環(huán)介導等溫擴增技術(shù)診斷兒童肺炎支原體肺炎準確性的Meta分析

張書婉,吳 爽,黃君華,曹三成

(1西安市兒童醫(yī)院檢驗科,西安 710003;2西安醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院;*通訊作者,E-mail:shuwan0103@163.com)

肺炎支原體肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia,MPP)是兒童最常見的呼吸道感染性疾病[1],占兒童社區(qū)獲得性肺炎的20%左右[2]。肺炎支原體(MP)感染常會導致兒童凝血功能紊亂[3]和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[4],是5歲以下兒童死亡的首位病因。另外,由于診斷不明確的MPP而增加經(jīng)驗性用藥,導致大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥菌株居高不下[5]。MP感染人體后癥狀不典型,部分患兒無明顯臨床癥狀,給早期診斷帶來困難。環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification assay,LAMP)是一種恒溫擴增技術(shù),不需要特殊PCR設(shè)備且結(jié)果可視化,成本低廉,檢測時間短,適合床旁檢測,應用呼吸道標本患兒接受性高。近年來LAMP逐漸應用于兒童MPP檢測,但不同的研究對LAMP診斷準確性的報道有較大差異[6-9]。本研究通過對LAMP診斷MPP的價值進行Meta分析,旨在探討LAMP的診斷準確性,為其進一步推廣應用提供依據(jù)。

1 方法

1.1 文獻檢索

由兩位人員(張書婉、吳爽)獨立在PubMed、Embase、Cochrane Library等英文文獻數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)、萬方等中文文獻數(shù)據(jù)庫進行文獻檢索及確定。文獻出版日期截止2018年11月27日。檢索詞為:英文文獻數(shù)據(jù)庫應用“LAMP”“l(fā)oop-mediated isothermal amplification assay”“Mycoplasmapneumoniae”“MP”“Mycoplasmapneumoniaepneumonia”“MPP”等檢索詞;中文文獻數(shù)據(jù)庫應用“LAMP”“環(huán)介導等溫擴增”“肺炎支原體”“肺炎支原體肺炎”等檢索詞。

1.2 文獻納入與排除標準

符合以下條件的文獻被納入本研究:評價了LAMP診斷MPP的價值;有明確的參考標準;通過文中數(shù)據(jù)可直接得到或計算出真陽性(TP)、假陽性(FP)、假陰性(FN)和真陰性(TN)例數(shù);兒童人群。文獻納入由兩位人員(張書婉、吳爽)根據(jù)標準獨立完成,不一致者由二人共同商討決定。

1.3 數(shù)據(jù)提取與文獻質(zhì)量評價

由兩位人員(張書婉、吳爽)獨立提取相關(guān)信息及數(shù)據(jù)并由第三位人員(黃君華)對提取結(jié)果進行檢查,不一致處由三人共同商討決定。所提取信息主要包括:第一作者、出版年代、國家、納入人群疾病類型、研究設(shè)計、標本類型、參考方法、LAMP方法及2×2列表數(shù)據(jù)。

每篇納入文獻的質(zhì)量應用“診斷準確性研究質(zhì)量評價(QUADAS-2)[10]”進行評價。主要評價“病例選擇”“待評價試驗”“參照標準”和“失訪、參照標準與待評價試驗的間隔時間”等4個方面。每個方面用“yes”“no”或“unclear”回答標志性的問題進行評價,發(fā)表偏倚用“l(fā)ow”“high”或“unclear”表示。對前3個方面還用“l(fā)ow”“high”或“unclear”評價其臨床適用性。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用隨機效應模型進行Meta分析。所納入的每一個研究都計算了敏感度、特異度、陽性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)和診斷比值比(DOR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)。用綜合受試者工作特征曲線(SROC)及曲線下面積(AUC)評價LAMP的綜合表現(xiàn)。用Meta回歸分析探討異質(zhì)性的來源,P<0.05或I2>50%表明差異有統(tǒng)計學意義。用Deek’s法檢測發(fā)表偏倚。所有的統(tǒng)計學分析由Stata/SE 15.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果

通過數(shù)據(jù)庫檢索共納入417篇文獻。其中通過Endnote X6排除重復檢索301篇;按照納入和排除標準,通過閱讀文章題目和摘要排除96篇,通過閱讀全文排除13篇;最終納入7篇文獻[6-9,11-13]。其中一篇文獻分別應用兩種不同的標本對LAMP進行評價,因此共有8組數(shù)據(jù)納入Meta分析。文獻篩選過程見圖1。

圖1 本Meta分析中符合納入標準的文章篩選流程圖Figure 1 Flow chart of selection progress for eligible studies of the meta-analysis

2.2 納入文獻的特征及質(zhì)量評價

Meta分析納入的7篇文獻為2012-2018年出版,來自中國和日本。共納入樣本1 377例,其中急性社區(qū)獲得性下呼吸道感染(ACA-LRTI)患兒249例(2篇文獻)[8,11],社區(qū)獲得性肺炎(CAP)1 065例(4篇文獻)[6,9,12,13],一篇文獻納入患兒(63例)的疾病情況不明[7]。另外,Kakuya等[8]的研究納入58例ACA-LRTI兒童分別用口咽拭子和鼻咽拭子兩種采樣標本檢驗LAMP的診斷準確性,本研究將兩種方法均納入分析,因此共有8組數(shù)據(jù)。納入文獻的主要特征見表1。

表1 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)診斷兒童肺炎支原體肺炎準確性的meta分析納入文獻的基本特征

Table 1 Characteristics of the study included in the Meta-analysis of LAMP forMycoplasmapneumoniaepneumonia in children

文獻及出版年份國家納入對象疾病種類研究類型 標本類型 LAMP方法 參照方法TPFPFNTNGotoh等,2012[13]日本CAP前瞻性研究 咽拭子In-house血清學方法2998322Gotoh等,2013[12]日本CAP前瞻性研究 咽拭子In-house血清學方法2352313260李丹等,2014[6]中國CAP回顧性研究 咽拭子In-houseQPCR351118Kakuya等,2014[11]日本ACA-LRTI前瞻性研究 咽拭子In-house培養(yǎng)3001160Aizawa等,2014[9]日本CAP前瞻性研究 咽拭子試劑盒(日本榮研化學)血清學方法4302 66Kakuya等(a),2017[8]日本ACA-LRTI前瞻性研究 口咽拭子試劑盒(日本榮研化學)QPCR1500 43Kakuya等(b),2017[8]日本ACA-LRTI前瞻性研究 鼻咽拭子試劑盒(日本榮研化學)QPCR 807 43Wang等,2018[7]中國未知回顧性研究 口咽拭子(45例)支氣管肺泡灌洗液(18例)In-houseQPCR3201 30

CAP:community-acquired pneumonia,社區(qū)獲得性肺炎;ACA-LRTI:acute community-acquired lower respiratory tract infections,急性社區(qū)獲得性下呼吸道感染;QPCR:熒光定量聚合酶鏈反應;In-house:實驗室內(nèi)部設(shè)計的LAMP方法,非商品化試劑盒;TP:真陽性例數(shù);FP:假陽性例數(shù);FN:假陰性例數(shù);TN:真陰性例數(shù)。文獻[8]對同一患兒分別用口咽拭子和鼻咽拭子兩種標本檢驗LAMP的診斷準確性,因此將兩種方法分別納入

根據(jù)QUADAS-2量表,4篇(50%)文獻“病例選擇”偏倚為低風險;3篇(37.5%)文獻“參照標準”偏倚為“unclear”;“待評價試驗”(index test)和“失訪、參照標準與待評價試驗的間隔時間”(flow and timing)偏倚方面所納入文獻均為低風險。臨床適用性(applicability concerns)方面,“patient selection”“index test”和“reference standard”低偏倚文獻所占比例較大,分別為87.5%,100%和62.5%(見圖2),說明本研究所納入的文獻總體質(zhì)量較佳。

圖2 納入文獻的偏倚風險和臨床適用性情況百分條圖Figure 2 Risk of bias and percentage bar graph of applicability concern of enrolled references

每篇納入文獻偏倚風險和臨床適用性的具體情況見圖3。根據(jù)QUADAS-2的標準,Wang等[7]的研究所納入患兒的疾病類型不明,對判斷LAMP診斷準確性可能存在高偏倚;Kakuya等[8,11]的兩篇論文所納入的患兒均為急性社區(qū)獲得性下呼吸道感染(ACA-LRTI)和非社區(qū)獲得性肺炎(CAP),因此不清楚是否會對LAMP的綜合診斷準確性造成影響。Aizawa等[9]和Gotoh等[12,13]的研究以血清學方法為參考標準,而非培養(yǎng)或PCR方法,不清楚是否會對LAMP的綜合診斷準確性造成影響。

2.3 診斷準確性和異質(zhì)性分析

用隨機效應模型進行meta分析發(fā)現(xiàn)合并敏感度和特異度分別為0.94(95%CI 0.84-0.98)和0.99(95%CI 0.94-1.00)(見圖4),說明LAMP診斷兒童MPP時特異度高于敏感度,更適合作為確診試驗應用于臨床實踐。PLR、NLR和DOR分別為138.01(95%CI 15.38-1 238.65)、0.06(95%CI 0.02-0.17)和2 200.68(95%CI 181.38-26 701.19)(見圖5),表明LAMP結(jié)果陽性時患MPP的可能性是不患MPP的138倍,而當結(jié)果陰性時患MPP與不患MPP的機會比為6%。DOR遠大于1,說明LAMP對MPP有很好的判別效果。SROC顯示AUC為0.99(95%CI 0.98-1.00)(見圖6),說明LAMP診斷兒童MPP的綜合效能很理想。

圖3 每篇納入文獻的偏倚風險和臨床適用性情況Figure 3 Risk of bias and applicability concern summary of enrolled references

從森林圖(圖4和圖5)可以看到納入的8組數(shù)據(jù)存在異質(zhì)性,因此本研究對納入人群的疾病類型、研究類型、參照方法和試驗方法等方面進行Meta回歸分析,發(fā)現(xiàn)上述四方面在特異度上差異有統(tǒng)計學意義(見圖7)。

圖4 LAMP診斷MPP敏感度和特異度的森林圖Figure 4 Forest plot of sensitivity and specificity for the diagnostic accuracy of LAMP

2.4 亞組分析

本研究對文獻中納入人群疾病類型、研究類型、參照方法和試驗方法進行亞組分析,發(fā)現(xiàn)以社區(qū)獲得性肺炎(CAP)為研究人群較急性社區(qū)獲得性下呼吸道感染(ACA-LRTI)人群LAMP的敏感度高但特異性低;回顧性研究的敏感度高于前瞻性研究,二者特異度相近;參考方法方面,以血清學方法為參考標準時LAMP的敏感度和特異度較低;試劑盒檢測的敏感度為91%,較in-house低(93%),但特異性高(見表2)。

圖5 LAMP診斷MPP陽性似然比、陰性似然比和診斷比值比的森林圖Figure 5 Forest plot of positive likelihood ratio, negative likelihood ratio and diagnostic odds ratio for the diagnostic accuracy of LAMP

圖6 LAMP診斷兒童MPP的SROC曲線Figure 6 Summary receiver operating characteristic curve of LAMP diagnostic value in children MPP

2.5 發(fā)表偏倚

Deek’s檢驗表明沒有統(tǒng)計學證據(jù)支持發(fā)表偏倚(P=0.21),說明本研究所納入的文獻無潛在的發(fā)表偏倚(見圖8)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖7 疾病類型、研究類型、參照方法及試驗方法的Meta回歸分析Figure 7 Meta-regression analysis of disease type, study type, reference, and LAMP assay

表2 疾病類型、研究類型、參照方法及試驗方法的亞組meta分析結(jié)果

Table 2 Summary of subgroup analysis of the included studies by different study characteristics

亞組文獻篇數(shù)敏感度(95% CI)特異度(95%CI)合并后總結(jié)果80.94(0.84-0.98)0.99(0.94-1.00)疾病類型 CAP40.92(0.85-0.96)0.95(0.91-0.98) ACA-LRTI30.87(0.63-0.93)1.00(0.94-1.00)研究類型 前瞻性研究60.92(0.78-0.97)1.00(0.90-1.00) 回顧性研究20.97(0.84-1.00)0.98(0.81-1.00)參考方法 QPCR40.95(0.69-0.99)0.99(0.79-1.00) 血清學方法30.93(0.79-0.95)0.95(0.96-0.98) 培養(yǎng)法10.97(0.83-1.00)1.00(0.98-1.00)試驗方法 In-house40.93(0.85-0.97)0.95(0.91-0.97) 試劑盒40.91(0.68-0.95)1.00(0.94-1.00)

圖8 評價納入文獻發(fā)表偏倚的漏斗圖Figure 8 Funnel graph for the assessment of potential publication bias of included studies

3 討論

LAMP是一種恒溫核酸擴增技術(shù),由于其具有檢測時間短,結(jié)果可視化,無需特殊儀器等優(yōu)點,已被廣泛應用于病原體的檢測[14]。肺炎支原體(MP)是引起兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要病原菌之一,該病原體無細胞壁,難以培養(yǎng),僅對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物敏感,且近年來耐藥趨勢逐漸上升,因此對MP的快速準確診斷尤為重要。LAMP技術(shù)以其自身的優(yōu)點被人們越來越多地應用于診斷肺炎支原體肺炎(MPP)及其他感染性疾病,已有文獻[15-18]對LAMP檢測其他病原體(如結(jié)核分枝桿菌、艱難梭菌等)的診斷準確性進行了Meta分析,但至今沒有相關(guān)報道對LAMP診斷兒童MPP準確性進行系統(tǒng)綜述,因此本研究應用Meta分析來評價LAMP診斷兒童MPP的準確性。

本研究結(jié)果顯示LAMP診斷兒童肺炎支原體肺炎的合并敏感度和特異度分別為94%和99%,說明其是一種診斷兒童MPP的有效工具;陽性似然比(PLR)為138.01,表明LAMP結(jié)果陽性時患MPP的可能性是不患MPP的138倍;陰性似然比(NLR)為0.06,說明LAMP結(jié)果陰性時患MPP與不患MPP的機會比為6%;DOR(2 200.68)遠大于1,說明LAMP對MPP有很好的判別效果。另外,為闡明LAMP的綜合診斷能力,本研究計算了SROC曲線的AUC(為0.99)表明LAMP技術(shù)能很好地診斷MPP。Chen等[15]應用Meta分析探討LAMP檢測糞便標本中艱難梭菌的診斷準確性,發(fā)現(xiàn)其敏感度、特異度、PLR、NLR、DOR和AUC分別為0.93,0.98,47.72,0.07,745.19和0.98。Nagai等[16]報道LAMP診斷肺結(jié)核的合并敏感度、特異度和DOR分別為89.6%,94.0%和145。結(jié)合本研究的結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)LAMP的特異性優(yōu)于敏感性,說明其對疾病的肯定診斷優(yōu)于對疾病的篩查。

異質(zhì)性是干擾Meta分析結(jié)果的主要問題,I2顯示各研究間存在明顯的異質(zhì)性,因此本研究進一步通過Meta回歸試圖尋找異質(zhì)性的來源。通過對納入人群疾病類型、研究類型、參照方法和試驗方法等方面進行Meta回歸,發(fā)現(xiàn)四方面均會對特異度產(chǎn)生顯著的影響,因此對其進行亞組分析。亞組分析可見對CAP患兒和ACA-LRTI患兒,LAMP的敏感度分別為92%和87%,特異度分別為95%和100%;回顧性研究的敏感度(97%)高于前瞻性研究(92%),二者特異度相似(分別為100%和98%);以血清學方法為參考標準時LAMP敏感度和特異度較低(分別為93%和95%),以培養(yǎng)法為參考標準時敏感度和特異度最高(分別為97%和100%),以QPCR為參考標準時敏感度和特異度介于前兩者之間(分別為93%和95%);試劑盒和in-house檢測的敏感度分別為91%和93%,特異度分別為100%和95%。由此可以推斷造成不同研究LAMP敏感度和特異度不同的原因主要有納入人群疾病類型、研究類型、參照方法和試驗方法等。另外,納入研究的患兒年齡在0.1歲至17歲之間,各個研究均未對具體年齡進行分組,對不同年齡段的患兒LAMP的診斷效能情況無法進行分析,可能是造成異質(zhì)性的原因之一。有研究[8]表明不同的標本類型對LAMP診斷MPP的準確性有影響,口咽拭子的敏感性高于鼻咽拭子,本Meta分析納入的研究標本類型多為“咽拭子”,無法區(qū)別是“口咽拭子”還是“鼻咽拭子”,因此無法對標本類型進行亞組分析,也可能造成不同研究間的異質(zhì)性。

本研究雖對LAMP的特性進行了有效地評估,但仍然存在一些問題。首先,納入的文獻多數(shù)未交代是否使用盲法,導致“病例選擇”和“參照標準”兩方面的偏倚風險不明;其次,文獻納入的研究對象不同,目標對象群體MPP的患病率不同也會對合并后的結(jié)果造成偏倚;最后,所有研究均來自中國和日本,無法獲知種族方面是否存在偏倚。

綜上所述,本研究系統(tǒng)地對LAMP診斷兒童MPP的效能進行了Meta分析。盡管存在一些局限性,但當前證據(jù)表明LAMP在兒童MPP的診斷中有很高的價值,可有效輔助臨床開展對MPP的早期診斷。然而我們?nèi)匀恍枰喔哔|(zhì)量的前瞻性研究診斷試驗研究證據(jù)對LAMP進行更加科學和全面的評價。