碳量子點對甜瓜幼苗鎘脅迫的緩解作用

王運強　肖煉　鄒正康　楊道勇　李俊麗　戴照義

摘 ? ?要：為探究碳量子點對植物鎘脅迫的緩解作用，在含Cd2+的水培系統(tǒng)中加入不同濃度的碳量子點研究其對甜瓜生長發(fā)育的影響。結果表明，碳量子點能降低甜瓜幼苗根和葉中的Cd2+含量（11.4%～82%），緩解Cd2+對甜瓜生長的抑制作用。另外，碳量子點能提高葉綠素含量（8.5%～10.7%），降低根系活力、花青素、MDA含量（12.5%～14.4%）和POD活性，減弱Cd2+對葉綠素合成的阻礙，并通過調節(jié)根中代謝使可溶性蛋白含量增加抵御鎘脅迫，提高根中CAT和葉中APX等酶的防御功能。綜上所述，75 mg·L-1碳量子點對50 mg·L-1以下Cd2+造成的鎘毒害修復作用最佳，為碳量子點作為一種新型重金屬毒害修復劑在農(nóng)業(yè)上的應用提供了參考。

關鍵詞：甜瓜;碳量子點;鎘離子;抗氧化酶 ;緩解

Abstract： In order to explore the alleviation effect of carbon quantum dots on cadmium stress in plants， different concentrations of carbon quantum dots were added to hydroponic systems containing cadmium ions （Cd2+） to cultivate melon seedlings. The results showed that carbon quantum dots can reduce the Cd2+（11.4%-82%）content in roots and leaves of melon seedlings， and alleviate the inhibitory effect of Cd2+ on melon seedlings growth. In addition， carbon quantum dots can increase chlorophyll content （8.5%-10.7%）， reduce the root activity， anthocyanin， MDA content （12.5%-14.4%） and POD activity， attenuate the inhibition of Cd2+ on chlorophyll synthesis， and restore soluble protein content to resist cadmium stress by regulating root metabolism， and restore the defense function of enzymes such as CAT in the root and APX in the leaves. In summary， 75 mg·L-1 carbon quantum dots have the best repair effect on cadmium toxicity caused by Cd2+ below 50 mg·L-1. These provide a new reference for the application of carbon quantum dots as a heavy metal poisoning repair agent in agriculture.

Key words： Melon; Carbon quantum dots; Cadmium ion; Antioxidant enzyme; Alleviation

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，在追求綠色文明的同時，環(huán)境污染問題也越來越受到人們的重視[1]。其中重金屬由于毒性大、污染范圍廣、潛伏時間長，已經(jīng)嚴重危害到生態(tài)環(huán)境[2]。鎘（Cd）由于其在環(huán)境中具有很強的遷移轉化特性及對人類健康的高度危害性而被列為第6位危害人類健康的有毒物質[3]。食物鏈是鎘對人類健康造成危害的主要途徑之一，而植物是生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，因而降低鎘在植物體內的積累和毒害作用顯得尤為重要[4-5]。已經(jīng)有很多研究報道了降低植物鎘毒害的方法，如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)硅（Si）可以減輕花生和玉米等植物中鎘的毒性、分布和抗氧化酶的刺激[6-7];Hu等[8]報道了過氧化氫預處理可降低水稻幼苗的鎘毒害和易位;Bai等[9]證明了添加200 μmol·L-1水楊酸可以顯著減輕鎘誘導的生理脅迫并促進黑麥草植物生長。這些方法存在應用率不高、使用范圍小、副作用大等缺點，仍需探索更加適宜的方法來緩解鎘毒害。

納米技術作為21世紀的高新科技已經(jīng)被應用于能源、信息、環(huán)境、生物醫(yī)學及國家安全等各個領域[10]。納米肥料、納米農(nóng)藥、納米塑料等納米材料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛的應用[11]。黃一帆[12]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化錳明顯減輕了鎘對水稻幼苗的生物量的影響，但是卻造成了更加嚴重的氧化應激反應。這可能是由于金屬納米材料本身會對植物造成一定的生理脅迫[13]。相比而言，碳納米材料由于其組分和獨特的物理化學特性，具有生物相容性好、細胞毒性小、易于吸收等優(yōu)良性質[14]。已經(jīng)有報道證實了碳納米材料對植物的生長發(fā)育存在促進作用，表現(xiàn)為促進植物的種子萌發(fā)、根系生長以及生物量積累[15]。此外Song等[16]發(fā)現(xiàn)了碳納米管能降低鎘對綠豆和蘿卜種子萌發(fā)和根系生長的毒害作用。這些都證明了碳納米材料在降低植物的重金屬毒害方面有著廣闊的應用前景。

在碳納米材料中，碳量子點（CQDs）以其生產(chǎn)成本低、水溶性好、高熒光穩(wěn)定性等優(yōu)異特性被證實在生物傳感、生物成像、藥物載體、光催化等眾多領域有優(yōu)異的應用價值[17]。Tripathi和Sarkar[18]報道了碳量子點能進入小麥體內，無植物毒性且能促進小麥根和葉的生長，增加作物產(chǎn)量。但是目前還沒有關于碳量子點對植物重金屬毒害影響的報道。甜瓜屬葫蘆科，一年生蔓性草本植物，味美香甜，除了富含營養(yǎng)價值外，還具有消暑熱、解煩渴、利小便等藥用價值[19]。甜瓜受到鎘毒害后，光合作用被顯著抑制，影響幼苗生長和后期的結果[20]。當Cd2+濃度達到5 mg·L-1以上時，甜瓜幼苗的鮮質量會明顯下降，表現(xiàn)出明顯的生長受阻現(xiàn)象[21]?；谝陨嫌^點，筆者探究了生理毒性較小的CQDs對受鎘毒害的甜瓜幼苗體內鎘積累量和生理生化影響，以期為CQDs作為新型植物鎘毒害修復劑的開發(fā)提供依據(jù)，也為CQDs在農(nóng)業(yè)上的安全應用做出評價。

1 材料與方法

1.1 材料

水溶性的碳量子點（CQDs）由武漢理工大學光纖傳感技術國家工程試驗室合成，其形狀和大小用Tecnai G2 20 TWIN 透射電子顯微鏡（TEM）（FEI，美國）測定，如圖1所示，平均粒徑為3～5 nm。

甜瓜種子（‘HCO14，厚皮甜瓜）由湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供，試驗中的水培營養(yǎng)液為改良型的霍格蘭營養(yǎng)液。

1.2 試驗設計

試驗于2017年3—7月在湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所南湖蔬菜試驗基地進行。首先挑選籽粒飽滿的甜瓜種子，用55 ℃溫水浸泡并不斷攪拌，待水溫降至室溫后浸泡3 h，撈起種子，洗凈甩干，用濕潤的紗布包裹，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱里催芽24 h，然后挑選芽長一致的甜瓜種子播種在消毒滅菌后的無鎘基質土中，然后放置在塑料大棚中培育。待幼苗子葉平展后，將甜瓜幼苗移栽到水培盆中，用去離子水進行適應性培養(yǎng)，每盆18株，放入溫度為28/18 ℃（16/8 h），光照為20 000/0 lx（16/8 h）的人工氣候箱。3 d后換用含1/4霍格蘭營養(yǎng)液（pH 5.6）培養(yǎng)，每隔5 d更換1次1/4營養(yǎng)液。培養(yǎng)10 d后，用從預試驗中得到的對甜瓜幼苗無生理毒性且有一定生長促進作用的碳量子點質量濃度50和75 mg·L-1，以及對甜瓜幼苗生長有一定影響的鎘離子（氯化鎘）質量濃度20和50 mg·L-1進行處理。將試驗分為9個處理組，每組18株幼苗，每處理組3次重復，其處理濃度如表1所示。

表1 處理組的Cd2+和CQDs濃度

[處理組 Cd2+質量濃度/（mg·L-1） CQDs質量濃度/（mg·L-1） CK 0 0 G1 20 0 G2 50 0 T1 0 50 T2 0 75 G1T1 20 50 G1T2 20 75 G2T1 50 50 G2T2 50 75 ]

1.3 方法

待甜瓜幼苗在處理組中生長7 d后，用直尺測量植株的根長、莖長和總長，稱量植株鮮質量，105 ℃殺青，然后將其放在60 ℃烘箱中烘至恒重，稱量干質量并計算含水量。

將甜瓜幼苗用EDTA-Na2溶液洗凈，再用去離子水沖洗2～3遍，用不銹鋼工具把樣品的葉、莖和根分開，裝入牛皮紙信封，105 ℃殺青，在60 ℃烘箱內烘干至恒重。用料理機粉碎后，稱取適量植物樣品用濃硝酸和H2O2在100 ℃下進行消解，冷卻后用原子吸收分光光度計（GBC，澳大利亞）測定其中的Cd含量。

取每個處理組所有甜瓜幼苗的同一位置的葉和根分別剪碎混勻，再分別稱取0.3 g葉和根研磨均勻，將勻漿離心后用磷酸緩沖液（pH=7.8）定容到10 mL并保存在低溫下，用于測定植物組織的各項生理生化指標。用紅四氮唑（TTC）法測定根系活力[22];用乙醇浸泡葉片提取葉綠素，并用比色法測定葉綠素含量[23];用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量;用鹽酸乙醇（1∶100）浸泡提取并用比色法測定花青素含量[24];用硫代巴比妥酸（TBA）測定丙二醛（MDA）含量[25];用氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[25];用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[26];用紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性[27];用過氧化氫啟動抗壞血酸（AsA）和酶的反應并用比色法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2016和SPSS 22.0進行處理，利用Duncan 法進行多組樣本間的差異顯著性分析，用Origin 7.5繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 碳量子點和鎘對甜瓜幼苗生物量的影響

如圖2所示，在只含Cd2+的處理組中（G1和G2），甜瓜幼苗的鮮質量、干質量、根長和莖長都顯著低于對照，表明Cd2+對甜瓜幼苗具有很強的生長抑制作用。而在CQDs的處理組中，甜瓜的鮮質量和長度都與對照無明顯差異。相比于G1處理組，G1T1處理組的甜瓜幼苗的鮮質量高出27%，干質量的差異雖然不顯著，但是在數(shù)值上高19.9%，這證明CQDs的加入明顯緩解了鎘對甜瓜生物量的毒性。此外，G2處理組比G2T2處理組的根長短32.4%，莖長雖然差異不顯著，但是數(shù)值上低13.6%，這些都說明了CQDs能減輕Cd2+對甜瓜幼苗的生長抑制作用。

2.2 甜瓜幼苗的鎘積累量

如圖3所示，在只含Cd2+處理組中，甜瓜幼苗根中的鎘含量隨著Cd2+濃度的增加而增大。而在 G2T1和G2T2處理組的根中的鎘含量均顯著低于G2處理組，分別相當于G2組的88.6%和58.1%，，表明CQDs能夠有效阻礙Cd2+進入根中。G2T2處理組根中的鎘含量低于G2T1中的，表明隨著CQDs濃度的升高，根中的鎘含量降低越顯著。而在甜瓜幼苗的葉中，G2處理組的鎘含量低于G1處理組，可能是由于根中高濃度的Cd2+破壞了根細胞運輸功能，導致根中的Cd2+難以向上轉運。在G2T1和G2T2處理組中，葉中鎘含量顯著低于50 mg·L-1 Cd2+處理組（分別相當于G2組的30.1%和18.0%），證明加入CQDs也降低了葉中的鎘含量。結合圖2中的數(shù)據(jù)可知，CQDs可以通過減少Cd2+在植物體內的積累來緩解鎘對生長的抑制。

2.3 碳量子點和鎘對甜瓜幼苗的葉綠素和根系活力影響

如圖4-a所示，在只含Cd2+的處理組中，甜瓜幼苗的根系長度明顯比對照短，且須根數(shù)量比對照組少，表明Cd2+抑制甜瓜幼苗根系生長。在圖4-b中，只含鎘的處理組的幼苗根系活力顯著高于對照組，可能是Cd2+刺激了根系活力的增加。另外，我們發(fā)現(xiàn)同時含有Cd2+和CQDs的處理組的根系活力明顯低于只含Cd2+的處理組，且與對照組的根系活力相近。圖4-a中，明顯觀察到G2處理組的甜瓜幼苗葉子枯黃，這表明鎘對葉的強毒害作用。圖4-c中G2處理組的葉綠素含量明顯低于對照組，但G2T1和G2T2處理組中葉綠素含量比G2處理組分別高8.5%和10.7%，這表明CQDs能緩解鎘對甜瓜葉的毒害作用。

2.4 碳量子點和鎘對甜瓜幼苗可溶性蛋白和花青素含量的影響

圖5-a中，只含Cd2+的處理組根和葉中的可溶性蛋白含量隨著Cd2+的濃度增大而增加，表明鎘造成了甜瓜幼苗葉中的氧化脅迫。同時含有Cd2+和CQDs的處理組中根和葉的可溶性蛋白含量與相同濃度單獨的Cd2+處理組差異不顯著，但是隨著Cd2+的濃度增大，可溶性蛋白含量依舊增大。圖5-b中，G2處理組根中的花青素顯著高于對照，表明鎘對根造成了氧化損傷從而引起花青素含量增加。而在G2T1和G2T2處理組中，CQDs的加入顯著降低了甜瓜幼苗根中花青素含量，且隨著CQDs含量的增加花青素下降越明顯。

2.5 碳量子點和鎘對甜瓜幼苗葉片MDA含量的影響

在圖6中，G2處理組葉中的MDA含量顯著高于對照（高46.2%），表明Cd2+對甜瓜葉片造成了嚴重的氧化損傷，從而導致葉片中的細胞膜脂質過氧化。而G2T1和G2T2處理組中MDA含量顯著低于G2處理組（分別低14.4%和12.5%），表明CQDs能降低Cd2+對葉片的氧化刺激使MDA含量下降。

2.6 碳量子點和鎘對甜瓜幼苗抗氧化酶活性的影響

在圖7-a中，所有處理組根中的SOD活性與對照組中的比較無顯著差異，但是G2處理組葉中的SOD活性顯著高于對照組的（高29.8%）。而G2T1和G2T2處理組的SOD活性與對照差異不顯著，相對與G2處理組在數(shù)值上分別下降了6.4%和11.0%。圖7-b中，G1和G2處理組根中的POD活性明顯高于對照，且G2處理組葉中的POD活性也高于對照。而G2T1的處理組葉中的POD活性比G2處理組葉中的低25%，根中的雖然差異不顯著但是在數(shù)值上也低5.8%。圖7-c中，只含有Cd2+的處理組根中的CAT活性顯著低于對照組。而同時含有Cd2+和CQDs的處理組的CAT活性顯著高于只含Cd2+的處理組，且與對照組相似。在葉中，只含有Cd2+的處理組的CAT活性高于對照。同時加入CQDs的處理組的CAT活性雖然與單獨含鎘的處理組中的差異不顯著，但是數(shù)值上均存在不同程度的下降。在圖7-d中，所有含Cd2+處理組根中的APX活性均低于對照，而只含CQDs的處理組的APX活性與對照無差異。在葉中，G1處理組的APX活性明顯高于對照，但在G2處理組的APX活性卻低于G1處理組的。而在G1T1和G2T2處理組中，其APX活性均顯著高于G2處理組，分別高32.7%和90.0%。

3 討論與結論

Cd2+對植物的毒性通常表現(xiàn)為對生長特性和生物量的影響[29]。Li等[30]證明碳量子點對綠豆植物的生物量沒有顯著影響。本研究結果也表明CQDs對甜瓜幼苗無植物毒性，且能緩解Cd2+對甜瓜幼苗生長發(fā)育的抑制作用。通過檢測鎘含量，結果顯示CQDs降低了甜瓜根和葉中的鎘積累，且隨著CQDs的增加，降低鎘含量的效果越顯著。曾云龍等[31]證明了碳量子點可以通過吸附作用去除水中的重金屬離子（Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ni2+、Cd2+、Cr3+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Ag+等），用來降低環(huán)境污染和重金屬的回收利用。劉阿梅等[32]也報道了生物碳能降低植物地上部分的鎘含量，從而緩解鎘產(chǎn)生的生理脅迫。因此，我們推測是由于CQDs特有的納米結構使其能吸附水中的Cd2+，從而降低溶液中游離的Cd2+濃度，導致其不容易被植物吸收進入根，葉中的鎘含量也因此降低了。進一步的研究顯示，Cd2+對甜瓜根系活力有刺激作用，黃運湘等[33]也發(fā)現(xiàn)了鎘導致大豆幼苗根的根系活力升高的現(xiàn)象。吳恒梅等[34]也發(fā)現(xiàn)，Cd2+濃度為5 mg·L-1處理7 d后絲瓜幼苗的根系活力是高于對照的，隨著鎘離子濃度的升高根系活力逐漸下降到低于對照。這些表明Cd2+隨著濃度的增加，對根系活力的影響是先增加后下降的。本研究中甜瓜幼苗屬于對鎘抗性較強的植物，所以在20和50 mg·L-1 Cd2+處理下，甜瓜處于Cd2+刺激根系活力增加的濃度。而加入碳量子點根系活力恢復到與對照無明顯差異，表明CQDs對根中的鎘毒害有修復作用。此外，Cd2+也抑制甜瓜幼苗中葉綠素的合成，姜永雷等[35]也報道了Cd2+脅迫引起水蕨幼苗葉綠素含量下降，而CQDs能緩解鎘對葉綠素合成的抑制作用，進一步證明CQDs對葉也有修復作用。

另外，植物在重金屬脅迫下可溶性蛋白含量增加，會調整蛋白質的結構和功能，有助于維持細胞的正常代謝[36]。張永平等[20]證明了甜瓜幼苗的可溶性蛋白含量隨著鎘濃度的增加先升后降低。在本研究中，甜瓜根和葉中可溶性蛋白含量隨Cd2+濃度的增加而增加，表明植物的防御機制被激活，而同時含Cd2+和CQDs的處理組中可溶性蛋白含量無明顯變化，一種原因可能是抗氧化系統(tǒng)足以抵御鎘脅迫，其他的原因有待進一步研究?；ㄇ嗨厥且环N具有優(yōu)異的抗氧化功能并廣泛存在于植物中的天然色素[37]，其含量的增加有利于抵抗氧化刺激。戴靈鵬等[38]報道了花青素含量的增加是滿江紅抗性機理之一，可緩解Cd2+對植物的毒害。本研究中單獨的50 mg·L-1 Cd2+處理刺激甜瓜根中花青素含量顯著增加，CQDs的加入使花青素含量降低，表明CQDs緩解了Cd2+對甜瓜葉造成的氧化損傷。

MDA是植物膜脂質過氧化其產(chǎn)物之一，被用來衡量植物對逆境條件反應的強弱[39]。陳宏等[40]也發(fā)現(xiàn)了小麥幼苗經(jīng)鎘脅迫后，隨著鎘濃度的增高，葉片中的MDA的含量明顯升高，且葉片中MDA積累量高于根。研究結果表明CQDs的加入降低MDA的含量，表明CQDs緩解了鎘對細胞膜的刺激。抗氧化酶系統(tǒng)是植物抵抗逆境脅迫重要防御體系[41]，其中SOD是活性氧（ROS）的清除劑，將活性氧轉化為過氧化氫來維持活性氧的代謝平衡[42]。POD、CAT和APX均是可以清除過氧化氫的酶，用于減少過氧化物對細胞的氧化損傷[43]。50 mg·L-1 Cd2+增加了葉中的SOD活性表明其對甜瓜幼苗的葉片產(chǎn)生氧化刺激。姜武等[44]報道了鎘脅迫引起了鐵皮石斛SOD活性升高，且SOD活性與鎘濃度成正相關。結果顯示CQDs的加入可以顯著降低SOD活性，表明CQDs減少了活性氧的產(chǎn)生，從而緩解鎘毒害。單獨鎘處理使POD活性增加，說明Cd2+對甜瓜根和葉都產(chǎn)生了氧化刺激。段云青等[45]發(fā)現(xiàn)了小白菜的POD活性在一定范圍內均隨鎘脅迫強度的增加而升高。加入50 mg·L-1 CQDs后降低了甜瓜葉中POD的活性，進一步證明CQDs的解毒作用。單獨鎘處理使根中CAT活性下降，可能由于根中鎘含量較高產(chǎn)生的氧化刺激太強，導致抗氧化系統(tǒng)受損。在葉中單獨鎘處理卻導致CAT活性升高，表明鎘對葉產(chǎn)生氧化刺激，引起抗氧化酶活性增加來清除過氧化氫。趙士誠等[46]報道了鎘誘導玉米葉中CAT活性增加，且隨著鎘濃度增加，CAT活性逐步下降。本研究中CQDs使CAT的活性保持穩(wěn)定，說明其緩解了鎘對CAT活性的影響。在單獨鎘處理下，根和葉中APX的活性變化與CAT的相似。范慶等[47]發(fā)現(xiàn)了鎘脅迫導致矮牽牛幼苗葉片的APX活性顯著升高。本研究中在高濃度的鎘脅迫下，APX活性反而低于對照，可能是細胞受損嚴重導致APX功能紊亂，但是CQDs的加入使APX活性恢復正常，間接證明CQDs對鎘毒害的修復效果。

本試驗結果表明，Cd2+抑制甜瓜幼苗的干質量、鮮質量、根長和莖長等生長參數(shù)，而CQDs的能減輕鎘對甜瓜生長發(fā)育的抑制作用。此外CQDs顯著降低了甜瓜根和葉中的鎘積累量，從而緩解了鎘對根系活力和花青素的刺激，增加了葉綠素含量。盡管甜瓜本身對鎘的抗性較強，但50 mg·L-1 Cd2+仍然誘導了甜瓜葉中MDA含量增加和相關抗氧化酶活性的變化。加入CQDs后 ，除了緩解這些氧化應激，還能降低鎘對CAT、APX等酶活性的破壞，增加抗氧化酶活性來清除鎘產(chǎn)生的活性氧。這些都證明了CQDs能修復鎘對甜瓜幼苗的毒害作用，為其作為新型植物修復劑奠定了基礎。

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