太行山區(qū)酸棗葉化學(xué)成分的UPLC-QTOF-MS分析

葉 嘉，楊明建，楊香瑜，張 浩，昝立峰*

1邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院；2河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用研發(fā)中心，邯鄲 056005

酸棗(Ziziphusjujubavar.spinosa)隸屬于鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)木本植物，一種灌木或小喬木，廣泛分布于我國華北、西北等地，尤其在太行山地區(qū)野生資源十分豐富[1]。酸棗干燥成熟種子酸棗仁是中醫(yī)常用的寧心安神藥，具補(bǔ)肝、寧心、斂汗、生津等功效[2]。而酸棗葉在我國民間廣泛將其加工成茶，以養(yǎng)心安眠為其主要保健功效，具有利尿、促進(jìn)膽酸合成、消炎等多種活性，常稱作“東方睡葉”[3]?！侗静菥V目》中記載酸棗葉可“斂瘡解毒，治脛臁瘡”功能[4]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)酸棗葉中主要含有生物堿、黃酮、三萜皂苷、有機(jī)酸等多種類型的化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)靜抗驚厥、保溫作用，并且可使心腦血管收縮性增強(qiáng)，致使血壓持續(xù)下降[5]。

國內(nèi)對酸棗葉的研究多集中在酸棗葉茶的加工技術(shù)研究方面，而對酸棗葉的化學(xué)成分及藥理研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少。超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)兼具液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高檢測能力，在天然產(chǎn)物的分析研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。為了進(jìn)一步明確產(chǎn)自河北省太行山區(qū)酸棗葉的活性成分，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對其乙醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，建立酸棗葉化學(xué)成分的快速分析方法，為闡明其藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗葉于2017年8月采集于河北省冀南太行山區(qū)五指山，采集后經(jīng)攤晾、45 ℃烘干，5～8 ℃放置備用。

乙腈和甲酸為色譜級，其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。LX-17型大孔吸附樹脂由西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC-G2 QTOF 聯(lián)用系統(tǒng)(美國Waters 公司)；Waters BEH Amide 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；N-1200B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；Mill-Q Advantage A10 超純水儀(美國Millipore)；高速萬能粉碎機(jī)(常州市國旺儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

采用多功能高速粉碎機(jī)對酸棗葉樣進(jìn)行粉碎(20～40目)，準(zhǔn)確稱取粉碎后的酸棗葉200 g，用60%的乙醇在超聲波45 ℃輔助浸提2次，每次2 h，合并提取液并離心過濾，離心液在溫度為40 ℃減壓濃縮至無醇狀態(tài)的水溶液，水溶液采用大孔吸附樹脂吸附分離純化，75%乙醇解吸得到解吸液，解吸液減壓蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到3.6 g物質(zhì)，分析前用甲醇溶解并過0.22 μm濾膜，即得樣品溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為Waters BEH Amide(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相A為水溶液(含0.5%甲酸)，B相為乙腈，流動相梯度洗脫過程如下：10%A(0～1 min)，10%～100%A(1～45 min)，100%A(45～47 min)，100%～10%A(47～47.1 min)，10%A(47.1～50 min)；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫40 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)離子源，質(zhì)量掃描范圍質(zhì)荷比 (m/z) 100～2 000，掃描方式為正負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為3 000 V，樣品錐電壓40 V，提取錐電壓4 V，源溫110 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣流速度700 L/h。

圖1 酸棗葉提取物正(A)負(fù)(B)離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms in positive (A) and negative ion mode (B) of extracts from Ziziphus jujuba var. spinosa folium using UPLC-Q-TOF-MS

2 結(jié)果與分析

圖1為產(chǎn)自冀南太行山區(qū)酸棗葉乙醇提取物的UPLC-QTOF-MS總離子流色譜圖，從圖1中看出UPLC分離條件可以有效地將酸棗葉中的主要成分分開，在UPLC-QTOF-MS條件下得到質(zhì)譜圖，化學(xué)成分在ESI離子源正離子譜中主要出現(xiàn) [M+H]+準(zhǔn)分子離子峰；在負(fù)離子譜中黃酮、三萜酸、有機(jī)酸和脂肪酸主要出現(xiàn) [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，而三萜皂苷類物質(zhì)則具有基本相同的一級質(zhì)譜，基峰為 [M-H+HCOOH]-，二級質(zhì)譜主要的碎片峰為[M-H]-，總離子峰面積為213 762 mV·min。

鉆井液方面標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)工作走上了穩(wěn)步發(fā)展之路，近幾年來，一大批鉆井液方面的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制訂并頒布執(zhí)行，對鉆井工程專業(yè)產(chǎn)生了積極而深遠(yuǎn)的影響。通過宣傳、貫徹、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范了鉆井液技術(shù)行為，推動了我國鉆井液處理劑市場的健康發(fā)展以及鉆井整體技術(shù)工藝水平的提高。

2.1 黃酮類化合物

黃酮化合物的裂解規(guī)律已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道[6]，裂解規(guī)律相似，從酸棗葉乙醇提取物中共鑒定出10個(gè)黃酮成分，詳細(xì)結(jié)果見表1所示。

化合物1和2在正負(fù)離子模式下均產(chǎn)生相同的分子離子峰，推測其可能為同分異構(gòu)體，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)離子峰m/z595.166 4 [M-H]-，正離子模式下產(chǎn)生m/z597.183 3 [M+H]+的分子離子峰，確定化合物分子量為596，根據(jù)元素組成分析分子式為C27H32O15，二級、三級質(zhì)譜碎片中有碳苷的常見碎片丟失，參照文獻(xiàn)[7]并結(jié)合出峰時(shí)間推測化合物1和2分別為6,8-di-C-glucosyl-2(S)-naringenin或6,8-di-C-glucosyl-2(R)-naringenin。

化合物3和4在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z609.144 8 [M-H]-，碎片為463.087 6、301.032 9；正離子模式下化合物產(chǎn)生m/z611.160 9 [M+H]+的分子離子峰，二級質(zhì)譜碎片離子m/z465.102 3由m/z611.160 9失去一分子鼠李糖(146)產(chǎn)生，進(jìn)一步失去一分子葡萄糖(162)，產(chǎn)生碎片m/z303.050 3；確定化合物分子量為610，根據(jù)元素組成分析分子式為C27H30O16，且兩個(gè)化合物產(chǎn)生相同的分子離子峰，結(jié)合出峰時(shí)間，參考文獻(xiàn)[8]推測其分別為Quercetin-3-O-robinobioside和蘆丁。

化合物5和7負(fù)離子模式下產(chǎn)生m/z593.148 8 [M-H]-分子離子峰，正離子基峰m/z595.168 0 [M+H]+，確定化合物分子量為594，產(chǎn)生碎片離子m/z449.108 6由m/z595.108 6失去一分子鼠李糖(146)產(chǎn)生，進(jìn)一步失去一分子葡萄糖(162)，產(chǎn)生碎片m/z287.056 2；根據(jù)元素組成分析分子式為C27H30O15，且兩個(gè)化合物產(chǎn)生相同的分子離子峰，推測為同分異構(gòu)體，結(jié)合出峰時(shí)間并參考文獻(xiàn)[9]推測其分別為Kaempferol 3-glucoside-7-rhamnoside和Kaempferol 3-rhamnoside-7-glucoside。

化合物6正離子模式下產(chǎn)生m/z581.149 7 [M+H]+的分子離子峰，碎片峰m/z303.051 9 由母離子脫掉1 分子阿拉伯糖(132)和1分子鼠李糖(146)產(chǎn)生，查閱數(shù)據(jù)庫(Lipidomics Gateway)并參考文獻(xiàn)[9]推斷化合物為Kaempferol 3-rhamnoside-7-glucoside。

化合物8正離子分子離子峰為m/z447.092 3 [M+H]+，主要碎片為287.055 3和271.061 4，失去1分子葡萄糖苷(160)產(chǎn)生，并進(jìn)一步脫氧(16)產(chǎn)生271.055 3碎片；負(fù)離子模式下產(chǎn)生m/z445.075 5 [M-H]-離子峰，確定分子量為446，根據(jù)元素組成分析分子式為C21H18O11，由數(shù)據(jù)庫(Lipidomics Gateway)查閱推斷化合物為黃芩苷(Baicalein 7-glucuronide)。

化合物9在負(fù)離子模式下產(chǎn)生m/z563.140 1 [M-H]-的分子離子峰，主要碎片為431.099 9和285.031 7；而正離子模式下，化合物產(chǎn)生m/z565.155 0 [M+H]+的分子離子峰，主要碎片為433.102 8和287.056 2，確定化合物分子量為564，根據(jù)元素組成分析分子式為C22H28O14，碎片433.102 8為母離子脫掉1分子木糖(132)，繼續(xù)脫掉1分子鼠李糖(146)產(chǎn)生碎片287.056 2，參考文獻(xiàn)[9]確定化合物為Kaempferol 3-rhamnoside-7-xyloside。

表1 UPLC-Q-TOF-MS鑒定酸棗葉提取物中的黃酮化合物Table 1 The flavonoids identified from Ziziphus jujuba var. spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

圖2 化合物山奈酚-3-葡萄糖-7-鼠李糖和槲皮素-3-木糖苷-7-鼠李糖的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectra (positive mode) of compound kaempferol 3-glucoside-7-rhamnoside and quercetin 3-xyloside-7-rhamnoside

2.2 三萜皂苷

從酸棗葉中共鑒定出14個(gè)三萜皂苷成分，結(jié)構(gòu)以達(dá)瑪烷型三萜皂苷為主，糖多取代在C-3、C-20位，有L-鼠李糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、L-6-脫氧塔絡(luò)糖和乙酰鼠李糖等，詳細(xì)信息見表2所示。

化合物11在負(fù)離子模式下分子離子峰為m/z957.507 1 [M-H+HCOOH]-，而正離子模式下分子離子峰為m/z913.519 3 [M+H]+，確定分子量為912，分別失去1分子鼠李糖、1分子木糖、1分子葡萄糖產(chǎn)生碎片為767.454 0(146)、635.403 0(132)、473.340 4(162)，根據(jù)元素組成分析化合物分子式為C47H76O17，結(jié)合文獻(xiàn)[10]推測化合物為Zizynummin。

化合物12在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z1 103.563 8 [M-H+HCOOH]-，二級譜離子峰為m/z1 057.553 8 [M-H]-，而正離子模式下分子離子峰為m/z1 059.571 7 [M+H]+，確定分子量為1058，正離子模式產(chǎn)生碎片895.504 8、733.451 0、587.391 8、455.350 7，分別失去2分子葡萄糖、1分子鼠李糖和1分子阿拉伯糖。根據(jù)元素組成分析化合物分子式為C53H86O21，并查閱Chemical spider數(shù)據(jù)庫，推測該化合物為Ilekudinoside A(Oleanolic acid 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside])。

化合物13和20負(fù)離子峰為m/z941.510 6 [M-H+HCOOH]-，二級譜離子峰為m/z895.507 4 [M-H]-，正離子峰為m/z897.524 1 [M+H]+，分子量為896，分子式為C47H76O16。正離子峰分別失去2分子鼠李糖和1分子阿拉伯糖產(chǎn)生碎片733.455 4、587.395 7、455.354 8，參考文獻(xiàn)[11]，推測其為Jujubasaponin I(3-O-α-L-rhamnopyranosyl(l→2)-α-L-arabinopyranosyl-20-O-α-L-rhamnopyranosyl jujubogenin)及其異構(gòu)體(Oleanolic acid 3-O-β-D-glucosyl-(1→3)-α-L-ramnosyl(1→2)-α-L-arabinoside)。

化合物14和21負(fù)離子基峰為m/z983.523 6 [M-H+HCOOH]-，二級譜離子峰為m/z937.519 3 [M-H]-，正離子峰為m/z939.528 9 [M+H]+，綜合確定分子量為938，分子式為C49H78O17。正離子峰分別失去2分子鼠李糖和1分子阿拉伯糖產(chǎn)生碎片733.455 9、587.393 6、455.359 2，參考文獻(xiàn)[11]，并結(jié)合出峰時(shí)間推測其為Jujubasaponin II和Jujubasaponin III。

化合物15負(fù)離子基峰為m/z1 005.527 7 [M-H+HCOOH]-，二級譜離子峰為m/z959.523 3 [M-H]-，正離子峰為m/z961.539 1 [M+H]+，綜合確定分子量為942結(jié)合1分子水，分子式為C48H80O19(C48H78O18·H2O)。正離子峰產(chǎn)生碎片797.471 0 [961-hexosyl+H]+、651.402 7 [797-deoxyhexosyl+H]+，同時(shí)失去1分子半乳糖、1分子葡萄糖和1分子鼠李糖形成碎片587.395 8、489.359 9、455.357 9，結(jié)合文獻(xiàn)[12]，推測化合物為Jujubasaponin Ⅳ或Ⅴ。

化合物16正離子基峰為m/z797.474 4 [M+H]+，確定分子量為796，分子式為C42H68O14，產(chǎn)生碎片651.4125 [M+H-deoxyhexosyl]+，參考文獻(xiàn)[12]，推測化合物為Jujubasaponin Ⅵ[Trevoagenin D 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside]。

化合物17在正離子模式下基峰為m/z1 045.559 4 [M+H]+，分子量為1 044，分子式為C52H84O21，分別失去1分子L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、6-deoxy-L-talose和木糖產(chǎn)生碎片947.521 0、733.452 1、587.395 0、455.352 9，參照文獻(xiàn)[13]推測化合物為Zizyphus saponin III。

化合物18和19在正離子模式下基峰為m/z931.528 4 [M+H]+，分子量為930，分子式為C47H78O18·H2O，分別失去1分子阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖，產(chǎn)生碎片785.467 4、653.424 0、455.359 2。參照文獻(xiàn)[13]并根據(jù)出峰時(shí)間推測化合物為Zizyphus saponin I和II。

化合物22正離子基峰為m/z1 075.570 8 [M+H]+，分子量為1 074，分子式為C53H86O22，結(jié)合碎片信息參照文獻(xiàn)[14]鑒定為Jujuboside I。

化合物23和24在正離子模式下基峰為m/z981.541 2 [M+H]+，分子量為980，分子式為C51H80O18，失去系列糖產(chǎn)生碎片835.484 4、733.453 4、587.391 5、455.351 5，結(jié)合文獻(xiàn)[15]推測化合物分別為Ziziphin和其異構(gòu)體(3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-20-O-(2,3-di-O-acetyl)-α-L-rhamnopyranosyl jujubogenin)。

表2 UPLC-Q-TOF-MS鑒定酸棗葉生茶中的皂苷化合物Table 2 The saponins identified from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

圖3 化合物大棗皂苷 I和Ziziphin的質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectra (positive mode) of compound zizyphus saponin I and ziziphin

2.3 三萜酸

酸棗葉中含有大量的三萜酸類次生代謝產(chǎn)物，主要結(jié)構(gòu)為羽扇豆烷型、齊墩果烷型及美洲茶烷型等五環(huán)三萜類。裂解規(guī)律具有基本相同的一級質(zhì)譜，如化合物25和34具有相同的基峰和碎片離子，在負(fù)離子模式下基峰為m/z485.326 7 [M-H]-，2倍分子量m/z971.661 4 [2M-H]-，失去1分子水產(chǎn)生碎片469.332 6，正離子模式下基峰為m/z487.342 4 [M+H]+，2倍分子量 [2M-H]-為m/z973.675 8，確定化合物分子量為486，正離子模式失去1分子羧基產(chǎn)生碎片441.336 8，進(jìn)一步失去1分子水產(chǎn)生碎片為423.320 1。根據(jù)元素組成分析化合物分子式為C30H46O5，結(jié)合化合物出峰時(shí)間，推斷化合物25和34分別為美洲茶酸(Ceanothic acid)和異美洲茶酸(Epiceanothic acid)。其他三萜化合物裂解規(guī)律與化合物25相似或相同，結(jié)合文獻(xiàn)[16-19]共鑒定出13個(gè)三萜類化合物，結(jié)果如表3所示。

表3 UPLC-Q-TOF-MS鑒定酸棗葉中的三萜酸化合物Table 3 The triterpenic acids from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

圖4 化合物美洲茶酸(正)和白樺脂酸(負(fù))的質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectra of compound ceanothic acid (positive mode) and betulinic acid (negative mode)

2.4 生物堿化合物

酸棗葉中生物堿可以延長環(huán)己烯巴比妥干預(yù)小鼠睡眠時(shí)間起到鎮(zhèn)靜作用，具有一定的安神作用[21]。通過化合物的分子基峰、碎片信息以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[20,21]，從酸棗葉中鑒定出3個(gè)生物堿化合物，見表4所示，其中化合物38在正離子模式下基峰為m/z286.144 8 [M+H]+，根據(jù)元素組成分析分子式為C17H19NO3，產(chǎn)生生物堿常見碎片107.049 6(C7H7O)，查閱Chemical spider數(shù)據(jù)庫并參考文獻(xiàn)，確定化合物為Coclaurine。同樣化合物39和40產(chǎn)生碎片信息為269.088 3(C17H17O3)和107.049 6(C7H7O)，確定化合物39和40為Zizyphusine和Lotusine。

表4 UPLC-Q-TOF-MS鑒定酸棗葉生茶中的生物堿化合物Table 4 The alkaloids identified from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

圖5 化合物烏藥堿和酸李堿的質(zhì)譜圖Fig.5 The mass spectra (positive mode) of compound coclaurine and zizyphusine

2.5 有機(jī)酸及脂肪酸

參照文獻(xiàn)報(bào)道有機(jī)酸和脂肪酸的裂解規(guī)律和質(zhì)譜特征，并結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(lipidomics gateway)檢索，共從酸棗葉醇提物種鑒定出13個(gè)有機(jī)酸和脂肪酸。如表5所示，裂解規(guī)律具有基本相同的一級質(zhì)譜，如化合物44，在負(fù)離子模式下基峰為m/z315.254 0 [M-H]-，確定化合物分子量為316，失去1分子水產(chǎn)生碎片297.238 6，根據(jù)元素組成分析化合物分子式為C18H36O4，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，推斷化合物44為9,10-Dihydroxystearic acid。

表5 UPLC-Q-TOF-MS鑒定酸棗葉中的有機(jī)酸和脂肪酸Table 5 The fatty acids from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

圖6 化合物十六烷酸和十八烷酸的質(zhì)譜圖Fig.6 The mass spectra (negative mode) of compound Hexadecanoic acid and Octadecanoic acid

3 結(jié)論

河北省冀南太行山區(qū)擁有豐富的酸棗資源，但綜合開發(fā)利用深度不夠，國內(nèi)外學(xué)者對酸棗仁進(jìn)行了大量的化學(xué)成分研究，但關(guān)于酸棗葉有效成分的系統(tǒng)認(rèn)識仍然不足。本研究采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)對酸棗葉乙醇提取物中的主要化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)定性分析，采用正離子、負(fù)離子兩種模式并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料對其成分進(jìn)行推斷，結(jié)果從酸棗葉乙醇提取物中鑒定出10個(gè)黃酮化合物、14個(gè)三萜皂苷、13個(gè)三萜酸、3個(gè)生物堿以及13脂肪酸物質(zhì)。根據(jù)離子峰面積計(jì)算黃酮相對含量為51.54%、三萜皂苷相對含量為11.77%、三萜酸相對含量為17.00%、生物堿相對含量為11.68%、脂肪酸相對含量為6.95%，從相對含量分析發(fā)現(xiàn)酸棗葉中黃酮相對含量較高，占總含量的一半以上；脂肪酸種類較多，但相對含量較低。有研究表明黃酮化合物蘆丁和6,8-di-C-glucosyl-2(S)-naringenin對血管有舒張作用，能拮抗血小板活化因子作用，可清除自由基，抑制生物膜上不飽合脂肪酸的過氧化而起到抗氧化作用，同時(shí)可延長戊巴比妥干預(yù)睡眠時(shí)間起到鎮(zhèn)靜作用，這與酸棗葉茶的養(yǎng)血安神作用相一致[8]。分析發(fā)現(xiàn)三萜皂苷類化合物為酸棗葉的主要成分，達(dá)瑪烷型三萜皂苷化合物Ziziphin及其衍生物Jujubasaponins II-VI能夠提高人體對蔗糖溶液味感的閾值起到甜味抑制作用，其中Ziziphin、Jujubasaponins II和III活性最強(qiáng)，可以作為甜味抑制劑產(chǎn)品的原料進(jìn)行開發(fā)[15]。齊墩果烷型三萜類化合物Oleanonic acid通過抗補(bǔ)體作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞功能而具有免疫調(diào)節(jié)作用，化合物Betulinic acid通過抑制COX-1、COX-2 活性而具有抗腫瘤活性，故可以作為腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑，或作為抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物[19,20]。酸棗葉中豐富多樣的物質(zhì)具有良好的改善心肌功能及抗心肌缺血作用和安神鎮(zhèn)靜等多種藥理活性和保健功能，這些化合物的發(fā)現(xiàn)可以為酸棗葉的功能深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。