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    連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

    2019-08-08 02:27:38湯韻秋全云云余琳媛李蕓霞
    關(guān)鍵詞:脂素連翹抗炎

    湯韻秋,全云云,余琳媛,鄭 立,李蕓霞

    成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,成都 611137

    炎癥是臨床中最常見的病癥之一,是人體為了確保去除有害刺激并修復(fù)受損組織的一種防御反應(yīng)。據(jù)流行病學(xué)和臨床資料顯示,多數(shù)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都伴隨有炎癥反應(yīng),炎癥還能加速疾病的發(fā)展[1]。此外炎癥反應(yīng)還可引起一些自身免疫疾病或癌癥,并且與許多慢性疾病如關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、阿爾察默病、心血管疾病、癡呆、癌癥、肥胖及Ⅱ型糖尿病等密切相關(guān)[2]。因此,研究開發(fā)具有抗炎作用的藥物對(duì)于臨床開發(fā)意義重大。臨床證實(shí),中國(guó)傳統(tǒng)中藥中具有抗炎作用的藥物眾多[3,4],明確抗炎有效成分以及探索其抗炎作用機(jī)制已經(jīng)成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)。

    中藥連翹為木犀科植物連翹(Forsythiasuspensa)的干燥果實(shí),其性寒、味辛苦、無毒、入肺、心、膽經(jīng)具有清熱解毒,疏散風(fēng)熱的功效[5],被喻為“瘡家圣藥”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床常用其治療急性呼吸道感染,皮膚化膿性感染、急性腎炎、肝炎、腦膜炎等病癥,以上病癥均與細(xì)菌、病毒引起的炎癥有關(guān)。關(guān)于連翹的抗炎作用成分研究一直是連翹研究的重點(diǎn)。連翹的主要化學(xué)成分多達(dá)150多種,主要包括木脂素類、苯乙醇苷類、五環(huán)三萜類和黃酮類等。對(duì)于連翹中的主要有效成分如連翹苷、連翹酯苷A等目前已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于它們的抗炎活性及作用機(jī)制[7-9],而連翹中的另一活性成分往往被人們忽視,即連翹脂(phillygenin)。連翹脂素是連翹苷的苷元,屬于雙環(huán)氧木脂素[10],是連翹中重要的木脂素類成分之一,被納為連翹的指紋成分。有研究表明連翹苷水溶性較差,口服吸收效果不理想[11],在用人肝癌細(xì)(SMMC-7721) 進(jìn)行體外活性研究中,連翹苷沒有活性,連翹脂素具有活性[12];在用小鼠黑色素肉瘤細(xì)胞B16對(duì)連翹脂素和連翹苷抗癌活性研究中,連翹苷沒有效果,而連翹脂素對(duì)小鼠黑色素肉瘤細(xì)胞B16有較強(qiáng)的抑制活性,甚至強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照的長(zhǎng)春新堿[13]。并且有實(shí)驗(yàn)通過大鼠腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化連翹苷發(fā)現(xiàn)連翹苷被迅速代謝為連翹脂素[14]。連翹脂素作為連翹苷的苷元也是連翹苷的代謝產(chǎn)物之一[15],猜想連翹苷發(fā)揮抗炎藥效是否有連翹脂素的參與。已有研究表明連翹脂素具有較強(qiáng)的抗炎,抗氧化,降血脂活性[16,17],但關(guān)于連翹脂素對(duì)炎癥因子影響及其機(jī)制方面的研究鮮見報(bào)道。

    當(dāng)人體免疫細(xì)胞在受到致炎因子作用時(shí),一些小分子量的、能在細(xì)胞間傳遞信息的、并且具有特異性免疫調(diào)節(jié)功能的可溶性蛋白質(zhì)或多肽通過機(jī)體本身分泌出來,并能參與或引起炎癥反應(yīng),這些物質(zhì)被稱為炎癥因子,包括NO、TNF-α、IL-6、PGE2、IL-1等[18]。NO、IL-6、TNF-α都是炎癥反應(yīng)中重要的細(xì)胞活性因子,它們對(duì)細(xì)胞炎癥都有直接或間接的作用,彼此之間也產(chǎn)生影響。NO是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的主要介質(zhì),氧化應(yīng)激能參與并加劇炎癥反應(yīng)[19]。IL-6作為一種多功能細(xì)胞因子,具有抗炎和致炎的雙向功能,其作用與組織中的含量有關(guān),正常水平的 IL-6對(duì)機(jī)體有利,產(chǎn)生過多會(huì)引起一系列炎性損傷[20]。TNF-α是一個(gè)經(jīng)典的炎癥指標(biāo),具有對(duì)IL-1β、IL-6等的協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)作用,處于炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),其表達(dá)量的多少可以直接反映炎癥的嚴(yán)重程度[21]。iNOS是NO合成酶,它的表達(dá)直接決定NO分泌量,是炎癥反應(yīng)檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。目前,調(diào)節(jié)NO的合成及其誘導(dǎo)型合成酶iNOS的表達(dá)被認(rèn)為是治療炎癥疾病的重要手段[22]。COX(環(huán)氧合酶)可以催化花生四烯酸生成前列腺素H2(PGH2),而PGH2是前列腺素的前體。COX有三種類型的同工酶,其中COX-2與炎癥的關(guān)系最為密切。COX-2 在正常細(xì)胞中表達(dá)量很低,但是在被激活的巨噬細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞中表達(dá)水平會(huì)迅速上升,是一種反映炎癥嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志酶[26]。

    因而為進(jìn)一步確定連翹脂素的抗炎作用及機(jī)制,本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為體外炎癥模型,觀察連翹脂素對(duì)炎癥因子NO、TNF-α、IL-6以及iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響,并以地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照,探討連翹脂素的抗炎作用及機(jī)制,以期為連翹脂素在臨床抗炎藥效的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞

    小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7,購(gòu)于上海元和生物有限公司。

    1.2 試藥與試劑

    連翹脂素(成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào)140722,≥ 98%);脂多糖(美國(guó)sigma公司,批號(hào)20160926);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,批號(hào)18460504);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司,批號(hào)SH40007.01);胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司,批號(hào)SH40003.01);噻唑藍(lán)(MTT,Biosharp公司,批號(hào)M-2128);青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào)B150608);鏈霉素(華北制藥股份有限公司,批號(hào)0171803202);二甲基亞砜(DMSO,成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)為2015110201);磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2~7.4,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)150907);硝酸還原酶法NO試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)20180530);IL-6,TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA) 檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物有限公司,批號(hào)201705,201705);BCA蛋白試劑盒(聯(lián)科生物,批號(hào)A81911151);引物(擎科生物公司合成);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(擎科生物,批號(hào)20180328);iNOS、COX-2抗體(Abcam公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

    BS 124 S型分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);TANKPE030型超純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司);SW-CJ-2FD型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo scientific公司);AE2000型相差倒置顯微鏡(廈門Motic公司);ALLEGER X-12型離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN Coulter公司);varioskan flash-3001型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo scientific公司);QTOWER實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)ANALYTIKJENA公司)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7,在含有抗生素(l00 U/mL青霉素、l00 U/mL鏈霉素)和10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)基中,于37 ℃,5% CO2的孵箱條件中培養(yǎng)。

    2.2 MTT法檢測(cè)raw264.7細(xì)胞增殖率

    取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞,以1×l05個(gè)/mL的密度將巨噬細(xì)胞懸濁液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每個(gè)孔加入100 μL細(xì)胞懸濁液,放入孵箱培養(yǎng)24 h。小心吸去上清,加入含不同濃度的連翹脂素或地塞米松(0、1、5、10、25、50、100、150、200 μg/mL)的DMEM溶液,每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)孔。放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μL MTT溶液,操作過程避光。放入孵箱繼續(xù)孵育4 h,小心吸去上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液,避光輕微震蕩,待培養(yǎng)板內(nèi)結(jié)晶完全溶解后,酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定OD值,并計(jì)算細(xì)胞增殖率(細(xì)胞增殖率大于90%表明此濃度的藥物對(duì)細(xì)胞增值無明顯抑制作用)。

    2.3 Griess法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量

    選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞,以1×105個(gè)/mL的密度將細(xì)胞懸濁液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每孔加入1 mL細(xì)胞懸液,孵箱培養(yǎng)24 h,小心吸去上清??瞻捉M加入DMEM溶液1 mL;LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液1 mL;LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液1 mL;陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50 μg/mL)地塞米松的DMEM溶液1 mL。放入細(xì)胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照NO試劑盒操作,每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)孔,使用酶標(biāo)儀于550 nm處測(cè)定OD值并計(jì)算NO含量。

    2.4 ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6釋放量

    取對(duì)數(shù)期巨噬細(xì)胞RAW264.7,并調(diào)整濃度后,以1×105個(gè)/mL的密度將細(xì)胞懸濁液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每孔加入1 mL細(xì)胞懸液,孵箱培養(yǎng)24 h,小心吸去上清。空白組加入DMEM溶液1 mL;LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液1 mL;LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液1 mL;陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50 μg/mL)地塞米松的DMEM溶液1 mL。放入細(xì)胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作后,于450 nm處測(cè)定各OD值,根OD值,計(jì)算 TNF-α、IL-6細(xì)胞因子釋放水平。

    2.5 Western blot 檢測(cè)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)

    取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度后,以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h,小心吸取上清??瞻捉M加入DMEM溶液3 mL;LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液3 mL;LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液3 mL;陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及地塞米松(50 μg/mL)的DMEM溶液3 mL,作用24 h后提取細(xì)胞總蛋白。將配制好的一抗(以抗體:5%BSA溶液1∶1 000稀釋)進(jìn)行免疫印跡,以GAPDH 作為內(nèi)參。顯影,并計(jì)算光密度值。

    2.6 RT-qPCR檢測(cè)iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)

    取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度后,以每孔1 × 106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h,小心吸取上清??瞻捉M加入DMEM溶液3 mL;LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液3 mL;LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液3 mL;陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及地塞米松(50 μg/mL)的DMEM溶液3 mL。作用24 h后,吸棄上清液,用PBS清洗2次,采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。按照擴(kuò)增試劑盒的程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以GAPDH做為內(nèi)參,分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 引物序列Table 1 Primer sequences

    3 結(jié)果

    3.1 連翹脂素及地塞米松對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

    采用MTT 法考察細(xì)胞經(jīng)不同濃度連翹脂素及地塞米松處理后RAW264.7細(xì)胞增殖活性的變化。圖1(A)所示,與空白組比較,連翹脂素在給藥濃度為0~100 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用。圖1(B)所示,地塞米松濃度在0~50 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取連翹脂素對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制的低、中、高濃度(5、50、100 μg/mL)開展研究,由于地塞米松100 μg/mL對(duì)細(xì)胞增殖有影響,于是選取5、50 μg/mL作為陽(yáng)性對(duì)照。

    圖1 連翹脂素及地塞米松對(duì)RAW264.7細(xì)胞增值的影響Fig.1 Effect of Phillygenin and dexamethasoneon proliferation of RAW264.7 cells

    3.2 連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

    圖2所示,LPS作用于RAW264.7 細(xì)胞,細(xì)胞上清液中的NO分泌量明顯增加,與空白組比較,具有顯著性差異 (P<0.01) ,說明LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥模型建立成功。連翹脂素各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的NO含量明顯低于LPS組(P<0.05、P<0.01) ,并呈劑量依懶性。地塞米松各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的NO含量顯著低于LPS組(P<0.01)。5 μg/mL連翹脂素組NO含量高于5 μg/mL地塞米松組(P<0.01)。50 μg/mL連翹脂素組NO含量與50 μg/mL地塞米松組無顯著性差異。

    圖2 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì) 胞NO釋放量的影響Fig.2 Effect of Phillygenine on content of NO in LPS induced RAW264.7cells注:與空白組比較##P<0.01;與 LPS 組比較 *P<0.05,**P<0.01.(下同)Note:Compare with control,##P<0.01;Compare with LPS, *P<0.05,**P<0.01.(The same below)

    3.3 連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-6釋放量的影響

    LPS作用于RAW264.7細(xì)胞,細(xì)胞上清液中的TNF-α和IL-6含量明顯增加,與空白組比較,具有顯著性差異(P<0.01)。連翹脂素各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的TNF-α,IL-6含量顯著低于LPS組(P<0.01),并呈劑量依懶性。地塞米松各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的TNF-α,IL-6含量顯著低于LPS組(P<0.01)。5 μg/mL連翹脂素組TNF-α,IL-6含量高于5 μg/mL地塞米松組(P<0.05)。50 μg/mL連翹脂素組TNF-α,IL-6含量與50 μg/mL地塞米松組無顯著性差異(見圖3)。

    圖3 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-6釋放量的影響Fig.3 Effect of Phillygenine on content of TNF-α,IL-6 in LPS induced RAW264.7cells注:與同濃度地塞米松比較△P<0.05。Note:Compare with same contentration as dexamethasone △P<0.05.

    3.4 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)下iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的

    如圖4所示,未加任何刺激的空白組細(xì)胞中,iNOS、COX-2蛋白未見表達(dá)。與空白組比較,LPS 可以使iNOS、COX-2蛋白顯著表達(dá),與 LPS 組比較,連翹脂素(5、50、100 μg/mL)呈濃度依賴性下調(diào)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)(P<0.05、P<0.01) ,尤其是連翹脂素高、中濃度組,對(duì)下調(diào)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)更為明顯(P<0.01)。說明連翹脂素通過下調(diào)激活RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)。由圖4(A)可見,與地塞米松相比,50 μg/mL連翹脂素與同濃度的地塞米松iNOS的蛋白表達(dá)量無明顯差異,表明連翹脂素有良好的抑制iNOS蛋白表達(dá)的作用。

    圖4 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of Phillygenine on LPS-induced iNOS,COX-2 protein expression in RAW264.7 cells注:與同濃度地塞米松比較△△P<0.01, (下同)。Note:Compare with same contentration as dexamethasone △△P<0.01,the same below.

    3.5 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)下iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)的影響

    如圖5所示,未加任何刺激的空白組細(xì)胞中,iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)量很少。與空白組比較,LPS可以使iNOS、COX-2 mRNA顯著表達(dá),與 LPS 組比較,連翹脂素(5、50、100 μg/mL) 呈濃度依賴性下調(diào)iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)(P<0.05、P<0.01) ,尤其是連翹脂素高、中濃度組,對(duì)下調(diào)iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)更為明顯(P<0.01)。由圖5(A)可見,與地塞米松相比,50 μg/mL連翹脂素與同濃度的地塞米松iNOS的mRNA表達(dá)量無明顯差異,表明連翹脂素有良好的抑制iNOS mRNA表達(dá)的作用。說明連翹脂素可以通過下調(diào)激活RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2 mRNA表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)。

    4 討論

    本研究通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型,探討連翹脂素的抗炎作用及其機(jī)制。在給藥濃度的確定上,本實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察連翹脂素各濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響,選取對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制(細(xì)胞增殖率大于90%)的低、中、高濃度(5、50、100 μg/mL)開展研究。陽(yáng)性藥地塞米松由于100 μg/mL對(duì)細(xì)胞增殖有影響(增殖率小于90%),所以選取對(duì)細(xì)胞無明顯抑制且與連翹脂素相等的濃度(5、50 μg/mL)作為對(duì)照。以10 ng/mL的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h,與空白組相比較發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清中NO、TNF-α和IL-6的表達(dá)均顯著性增加,表明LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥成功。

    圖5 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Phillygenine on LPS-induced iNOS,COX-2 mRNA expression in RAW264.7 cells

    本研究表明連翹脂素低、中、高濃度均可以抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO、TNF-α和 IL-6 表達(dá)上調(diào),并呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系,說明連翹脂素的抗炎作用與抑制NO、TNF-α和 IL-6 釋放有關(guān)。以地塞米松作對(duì)照,發(fā)現(xiàn)連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性小于地塞米松,低濃度(5 μg/mL)連翹脂素抑制NO、IL-6、TNF-α的釋放能力弱于地塞米松,中濃度(50 μg/mL)連翹脂素抑制NO、IL-6、TNF-α的釋放能力與地塞米松無顯著性差異,提示連翹酯素具有較強(qiáng)的抗炎作用。分析原因,可能是由于地塞米松相較于連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性更大,當(dāng)給藥濃度為5 μg/mL時(shí),由于濃度足夠低,毒性可以忽略,于是可以體現(xiàn)地塞米松良好的抗炎作用;而當(dāng)給藥濃度為50 μg/mL時(shí),同樣的濃度,地塞米松對(duì)細(xì)胞的毒性較連翹脂素更大,更容易引起細(xì)胞分化,導(dǎo)致給藥效果不如連翹脂素。

    在確定了連翹脂素具有良好的抗炎作用的基礎(chǔ)上進(jìn)行了對(duì)其抗炎機(jī)制的研究,發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào),翹脂素低、中、高濃度均可以抑制它們的表達(dá),并呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系,說明連翹脂素的抗炎機(jī)制與抑制iNOS、COX-2蛋白及mRNA的表達(dá)有關(guān)。與地塞米松相比,50 μg/mL連翹脂素與同濃度地塞米松對(duì)iNOS蛋白及mRNA的表達(dá)的抑制作用無顯著性差異,表明連翹脂素具有良好的抑制iNOS表達(dá)的藥理活性。

    綜上所述,連翹脂素可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO、TNF-α和 IL-6 ,其作用機(jī)制與抑制iNOS、COX-2蛋白及mRNA的表達(dá)有關(guān)。與地塞米松相比較,連翹脂素的抗炎效果良好,毒性較地塞米松更小,表明連翹脂素在抗炎活性方面具有巨大的開發(fā)潛力。

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