基于UPLC法測定離體大鼠及人源腸道菌對三七中人參皂苷代謝的差異

李根林，齊月娟，李寒冰，呂 寧，姜文軒，吳宿慧

河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046

腸道菌群與中藥相互作用的研究是當(dāng)前中醫(yī)藥發(fā)展中的熱點(diǎn)問題之一[1]。中藥在口服使用及實(shí)驗(yàn)研究中，與機(jī)體腸道菌群接觸并相互影響，且腸道菌與居住環(huán)境、生活飲食等多方面有關(guān)，在不同的種屬中也存在巨大的差異。研究表明人體腸道菌主要由Bacteroidetes和Firmicutes組成。而實(shí)驗(yàn)鼠通過人工飼養(yǎng)后，飲食習(xí)慣、生活環(huán)境基本相同，所以其腸道菌組成大致相同，大鼠腸道菌主要以Burkholderiales、Sphingobacteria、Sphingobateriales、α-變形桿菌和β-變形桿菌為主；而小鼠腸道菌則是以Firmicutes和Bacteroidetes為主，近幾年發(fā)現(xiàn)小鼠的不同腸道部位的菌群組成是不相同的，小腸中主要有Actinobacteria和Proteobacteria，大腸中更多的是Mucispirillum、Alistipes、Lactobacillus、Prevotella、Barnesiella、Bacteroides和Pseudoflavonifractor[2]。因此，不同種屬來源的腸道菌對同一中藥的代謝過程可能存在本質(zhì)的區(qū)別。

三七是五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥根，味甘、微苦，性溫，2015版《中國藥典》載歸肝、胃經(jīng)，入血分。最早記載于《跌損妙方》，首次正確繪圖于《本草綱目》，屬人參屬，化學(xué)成分與人參相近相似，《本草綱目拾遺》有“人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一”之說[3]，是一味名貴中藥材，被廣泛應(yīng)用于臨床，目前也是人們常用的保健品之一，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)三七具有降血脂、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用，但是，如何科學(xué)理解種屬中腸道菌群種類的不同、個(gè)體間對藥物代謝的差異及藥理效應(yīng)的同質(zhì)性[4]，這將有可能是打開中藥現(xiàn)代研究的一把鑰匙。鑒于此，為了探究三七與不同種屬來源的腸道菌群相互作用后是否存在藥理效應(yīng)的差異，本實(shí)驗(yàn)擬提取離體大鼠及人源腸道菌，在體外厭氧模式下，開展對三七中幾種常見人參皂苷與不同來源腸道菌體外代謝差異性的比較藥理學(xué)研究，以期為三七臨床效應(yīng)的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 試劑

人參皂苷Rg1(20160811)、人參皂苷Re(1205A021)、人參皂苷 Rb1(2016530)、人參皂苷 Rd(20160816)均購自北京索萊寶科技有限公司；原人參二醇PPD(wkq16042905)、原人參三醇PPT(wkq16052203)均購自四川省維克奇生物科技有限公司；磷酸(20170206，色譜純 Dikma pure，HPLC Grade)；肉湯培養(yǎng)基(HB0384-1，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；瓊脂粉(01-023，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；甲醇(20170321，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；乙腈(20170201，科密歐試劑)；超純水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 主要儀器

厭氧工作站(YQX-Ⅱ，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司，混合氣體、氮?dú)?，微量臺(tái)式高速離心機(jī)(D2012，北京萊博聯(lián)泰科技有限公司)，電子天平(BS1500，上海友聲衡器有限公司)，十萬分之一電子天平(XS105，梅特勒-托利多集團(tuán))，多功能粉碎機(jī)(150T，鉑歐五金廠)，Easy Well自動(dòng)雙重純水器(ESM-I-30，上海茸研生化儀器廠)，超高效液相色譜儀(Waters Acquity H-Class，美國Waters，QSM四元溶劑管理器，SM-FTN樣品管理器，PDA檢測器，Empower色譜工作站)，光電濁度計(jì)(KJ.45-WZT-3，北京卓川電子科技有限公司)，微量臺(tái)式高速離心機(jī)(D2012，北京萊博聯(lián)泰科技有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(GHG-9071A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

3 藥材

實(shí)驗(yàn)用三七(規(guī)格：40頭)采購于云南文山。樣品經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科陳隨清教授鑒定為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根莖。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 三七水煎液的制備

取一定量三七，打粉后過40目篩，稱取10.0 g三七粉末，加入10倍量的純水浸泡30 min，加熱，沸騰后文火煮30 min，過濾得濾液1和濾渣1。取濾渣1加入6倍量的純水煮20 min，過濾得濾液2和濾渣2。合并兩次濾液(1、2)，濃縮至40 mL，得0.250 g/mL的三七水煎液。

4.2 鼠源/人源菌懸液的制備[5,6]

人源腸道菌懸液的制備：取3位健康男子(21～23歲，體重60～70 kg，身高172～178 cm，無抽煙、喝酒史，6個(gè)月內(nèi)無使用抗生素經(jīng)歷)清晨第一次排出的新鮮糞便，無菌、厭氧環(huán)境下混合均勻后稱量0.1 g，加入滅菌好的10 mL PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)緩沖液，混合均勻后得濃度為1%的人源腸道菌懸液。

鼠源菌懸液的制備：取3只健康SD大鼠(購自山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)：SCXK(魯)2014-0007)排出的新鮮糞便，在無菌、厭氧環(huán)境下稱量1.0 g，加入滅菌好的100 mL PBS(0.1 mol/L，pH7.4)緩沖液，混合均勻后得濃度為1%的鼠源腸道菌懸液。

4.3 三七水煎液含藥固體培養(yǎng)基的制備[5]

取5.4 g的肉湯培養(yǎng)基與5.4 g的瓊脂混合均勻，加入300 mL的純水充分溶解后滅菌待用。將三七水煎液置于70 ℃水浴鍋中30 min，瞬間轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱冷卻(巴氏滅菌法)，將3 mL 1.0 g/mL的三七水煎液加入2 mL PBS混勻既得0.6 g/mL的藥液，隨后倍比稀釋為0.3、0.15、0.075 g/mL的藥液。將已滅菌的培養(yǎng)皿放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入12.5mL已滅菌的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，取0.1 mL不同濃度0.6、0.3、0.15、0.075 g/mL的藥液，分別加入0.1 mL的菌懸液，混勻后用涂布器涂抹于培養(yǎng)基上，即得0.3、0.15、0.075、0.037 5 g/mL的含藥培養(yǎng)基。在無菌、厭氧條件下培養(yǎng)48 h，觀察判斷菌群的生長情況并計(jì)數(shù)。

4.4 三七水煎液含藥液體培養(yǎng)基的制備[7]

稱取0.9 g肉湯培養(yǎng)基，加50 mL純水，在121 ℃高溫下滅菌15 min，按照表1內(nèi)容配置空白組、三七水煎液組及三七+菌液共培養(yǎng)組，放置于無菌厭氧培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h后，每組各取三個(gè)平行管，在4 ℃、3 000 rpm離心10 min后，取上清液1 mL，加入甲醇1 mL漩渦混勻，4 ℃下靜置10 min，1 300 rpm離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，UPLC色譜法進(jìn)行三七水煎液與腸道菌共溫孵后的代謝產(chǎn)物測定。

表1 三七與菌液共培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基制備Table 1 Preparation of liquid medium for co-culture of Panax notoginseng and bacterial liquid

4.5 UPLC測定三七水煎液與腸道菌共溫孵的代謝物測定方法

4.5.1 色譜條件[8]

色譜柱：Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)，0.1%的磷酸水溶液(B)；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；梯度洗脫條件為0～3 min,19.0%A；4～5 min,20.0%A；6～12 min,21.0%A；13～24 min,31.0%A；25～32 min,35.0%A；33～43 min,60.0%A；44～45 min,70.0%A；46～48 min,80.0%A；49～55 min,19.0%A；55～58 min,19.0%A。進(jìn)樣量8 μL；檢測波長203 nm。

4.5.2 對照品溶液的配制

精密稱取[9]對照品人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、原人參二醇PPD、原人參三醇PPT適量，配置成含有人參皂苷Rg1 1.96、Re 2.02、Rb1 2.07、Rd 2.19 mg/mL、原人參二醇PPD 2.22 mg/mL、原人參三醇PPT 0.93 mg/mL的溶液。經(jīng)0.22 μm的濾頭過濾后采用二倍稀釋法，稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的混合對照品(n=8)。

4.5.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取上述“4.5.2”八個(gè)濃度混合對照品溶液8 μL注入超高效液相色譜儀,按“4.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測,記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(見表2、圖1)

精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取對照品母液，稀釋得Rg1 20.438、Re 21.063、Rb1 21.563、Rd 22.812、PPT 23.125、PPD 9.625 μg/mL的混合對照品，按照“4.5.1”項(xiàng)下色譜條件，平行測定6次，記錄其人參皂苷及原人參二醇/三醇的峰面積并計(jì)算RSD值。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取人源腸道菌與三七水煎液共溫孵的代謝產(chǎn)物6份，按照“4.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定其峰面積，計(jì)算其人參皂苷及原人參二醇PPD/三醇PPT的含量并計(jì)算RSD值。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取人源腸道菌與三七水煎液共溫孵的代謝產(chǎn)物分別在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h，按照“4.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算其人參皂苷及原人參二醇PPD/三醇PPT的含量及RSD值。

表2 相關(guān)系數(shù)考察Table 2 Investigation of correlation coefficient

圖1 混合對照品的UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatography of mixed reference materials

加樣回收率實(shí)驗(yàn)：取已知含量的人源腸道菌與三七水煎液的代謝產(chǎn)物樣品6份，加入相對應(yīng)樣品100%的對照品，按照“4.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算其人參皂苷及原人參二醇PPD/三醇PPT的回收率及RSD值。

5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

采用IBM SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組及以上的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，當(dāng)方差齊性(P>0.05)時(shí)多重比較用Dunnett分析，方差不齊性(P<0.05)時(shí)多重比較用Wilcoxon分析。P<0.05認(rèn)為數(shù)據(jù)間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01認(rèn)為數(shù)據(jù)間有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6 結(jié)果

6.1 三七水煎液對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

固體培養(yǎng)法結(jié)果顯示：陰性對照組只加藥考察藥物對培養(yǎng)基的影響發(fā)現(xiàn)并無菌落生成，表明環(huán)境及培養(yǎng)條件符合要求(見圖2)。與空白組相比，在0.037 5～0.3 g/mL范圍內(nèi)，三七水煎液隨著濃度的升高對大鼠(圖3)及人源(圖4)腸道菌群促進(jìn)作用增強(qiáng)。對菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的單因素方差分析結(jié)果表明：與人源空白組相比，0.037 5～0.3 g/mL給藥組菌落數(shù)有顯著性差異(P<0.01)，在此濃度范圍內(nèi)三七水煎液對腸道菌作用表現(xiàn)促進(jìn)；鼠源結(jié)果同人源，在此濃度范圍內(nèi)三七水煎液促進(jìn)腸道菌的生長(見表3)。

圖2 三七水煎液對培養(yǎng)基的影響Fig.2 Effect of Panax notoginseng decoction on medium.注:a為空白組，b-e為給藥組，濃度分別為0.0375、0.075、0.15、0.3g/m L(下同)。Note:a:blank control group,b-e:administration groups,concentrations were 0.0375,0.075,0.15,0.3g/mL,respectively,(similarly hereinafter).

圖3 三七水煎液對大鼠源腸道菌群的調(diào)節(jié)作用 Fig.3 The regulating effect of Panax notoginseng decoction on rats intestinal flora

圖4 三七水煎液對人源腸道菌群的調(diào)節(jié)作用 Fig.4 The regulating effect of Panax notoginseng decoction on human intestinal flora

表3 三七水煎液對人/鼠源腸道菌體外生長的影響Table 3 Effects of Panax notoginseng decoction on the growth of human/rats intestinal bacteria in

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

6.2 UPLC測定腸道菌對三七水煎液的代謝作用及代謝物鑒定

6.2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果：人參皂苷及原人參二醇/三醇的峰面積得Rg1、Re、Rb1、Rd、PPD、PPT的RSD值分別為0.96%、0.36%、0.51%、0.49%、2.55%、0.54%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：人參皂苷及原人參二醇PPD/三醇PPT的含量得Rg1、Re、Rb1、Rd、PPD、PPT的RSD值分別為0.31%、0.20%、0.33%、0.55%、7.46%、1.44%，表明樣品重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：人參皂苷及原人參二醇/三醇的含量得Rg1、Re、Rb1、Rd、PPD、PPT的RSD值分別為0.61%、0.52%、0.66%、0.77%、5.77%、4.21%，表明樣品在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Rg1、Re、Rb1、Rd、PPD、PPT的RSD值分別為0.70%、1.70%、1.17%、1.92%、2.55%、1.24%，如表4所示。

6.2.2 樣品測定結(jié)果

經(jīng)測定知三七中含有三醇型人參皂苷Rg1 9.450 0、Re 1.887 2 mg/g，二醇型人參皂苷Rb18.581 6、Rd 1.945 6 mg/g。三七水煎液中未檢測出原人參二醇PPD及原人參三醇PPT。經(jīng)過與大鼠腸道菌共培養(yǎng)后，三七中含有的二醇型皂苷含量有輕微降低，而三醇型皂苷含量未見明顯變化，但有少量PPT (0.018 4 mg/g)的生成。

表4 加樣回收率(n=6)Table 4 Sample recovery rate(n=6)

與人源腸道菌共培養(yǎng)后，三七中含有的二醇型、三醇型人參皂苷含量顯著降低，重要的是，在培養(yǎng)液中檢測到代謝產(chǎn)物PPD和PPT的存在，含量分別為0.213 6 mg/g及0.034 4 mg/g，見表5，圖5、6。

表5 UPLC法測定三七中四種人參皂苷的含量及與腸道菌共溫孵后代謝產(chǎn)物的含量(mean±S.D,n=4,mg/g)Table 5 Determination of four ginsenosides in Panax notoginseng and the content of metabolites co-incubated with intestinal bacteria by UPLC method (mean±S.D,n=4,mg/g)

圖5 人源/鼠源腸道菌對三七的代謝作用及代謝產(chǎn)物的測定Fig.5 Metabolism of human/rats gut microfloar to Panax notoginseng and determination of its metabolite

7 討論

眾所周知，中藥可直接調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)而影響健康，而腸道菌群亦能影響口服中藥在體內(nèi)的吸收、代謝、轉(zhuǎn)化等過程，從而影響藥物療效的發(fā)揮[10]。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)平板固體培養(yǎng)法研究了三七水煎液對腸道菌群生長情況的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.009 4 g/mL的三七水煎液對腸道菌生長無顯著影響，但在0.009 4～0.075 0 g/mL范圍內(nèi)，隨著三七水煎液濃度的升高，藥物對腸道菌群促進(jìn)作用顯著增強(qiáng)。提示：三七水煎液對腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，為離體進(jìn)行腸道菌孵育方法系統(tǒng)研究三七中皂苷類成分的代謝過程奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)我們將進(jìn)一步驗(yàn)證菌群種類的改變特征。

有文獻(xiàn)報(bào)道在常規(guī)藥理藥效實(shí)驗(yàn)中，哺乳類嚙齒目動(dòng)物大鼠與人的代謝模式最為相似，常被用來模擬人體的代謝，且SPF級(jí)別大鼠的腸道菌群比人和小鼠更加穩(wěn)定[12]。在對實(shí)驗(yàn)樣本的處理上，為了避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的個(gè)體差異，因此常選擇三例樣本的腸道菌群混勻后與藥物混合作為研究模式[13]。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC的方法對人源/鼠源腸道菌群與三七水煎液共溫孵培養(yǎng)48 h后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與三七水煎液的原有三醇型人參皂苷Rg1、Re及二醇型人參皂苷Rb1、Rd[14]含量相比，三七鼠源腸道菌代謝產(chǎn)物中二醇型皂苷含量略有降低，而人源腸道菌代謝產(chǎn)物中皂苷含量變化幅度相對較大，且有PPD與PPT生成，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6,7]。目前研究顯示離體人參皂苷的代謝主要是通過腸道內(nèi)BifidobacteriumK506、Eubac-teriumA-44、Prevotellaoris、FusobacteriumK-60、Paecilomy-cesBainiersp.、BacteroidesJY-6等協(xié)同完成的[15]。其中人參皂苷Re主要依靠BacteroidesJY-6生成Rh1和F1，并產(chǎn)生少量的PPT[16]；人參皂苷Rgl和Rbl是三七總皂苷中含量最高的2個(gè)成分，人參皂苷Rg1則主要通過腸道內(nèi)FusobacteriumK-60代謝生成苷元進(jìn)而發(fā)揮作用[17,18]；人參皂苷Rb1在厭氧和有氧環(huán)境下，被腸菌液代謝成為人參皂苷Rd、F2、CK，代謝產(chǎn)物相同，但代謝的快慢有所差異[19]，一般情況下，有氧代謝速率快于厭氧代謝速率[10]。在腸道菌的作用下，此類皂苷發(fā)生脫糖基反應(yīng)代謝成為相應(yīng)的單糖苷和苷元有可能是真正發(fā)揮藥效的物質(zhì)[6]

圖6 三七水煎液(A、B、C)、三七+人源菌共培養(yǎng)液(D、E、F)、三七+鼠源菌共培養(yǎng)液 (G、H、L)中皂苷含量的UPLC色譜圖Fig.6 Panax notoginseng decoction(A,B,C),Panax notoginseng + human bacteria co-culture solution(D,E,F), Panax notoginseng + rats bacteria co-culture solution (G,H,L) UPLC chromatogram of saponin content

。

值得說明的是，在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)原人參二醇PPD只在經(jīng)人源腸道菌代謝后的產(chǎn)物中特征性地出現(xiàn)，在鼠源腸道菌中并無產(chǎn)生，這是否與菌群來源的種屬差異有關(guān)，我們將作進(jìn)一步研究。另外，三七水煎液在與腸道菌共溫育的過程中，三七中的特征化合物如三七皂苷R1是否能被不同來源的腸道菌代謝及其可能的代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)與鑒定，我們也將繼續(xù)研究。

綜上所述，我們以三七為主進(jìn)行的體外中藥代謝研究及其分析方法可以部分還原中藥在口服途徑中被腸道菌代謝的反應(yīng)過程，可以通過“腸道菌群-宿主共代謝”途徑探討中藥的生物學(xué)作用機(jī)制[10]，也可以說明相當(dāng)一部分中藥的作用靶點(diǎn)可能是由人體共生微生物構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng)[20]，還可以探討動(dòng)物種屬差異對藥理效應(yīng)所產(chǎn)生的影響，為人類應(yīng)用的臨床研究與以動(dòng)物為主的實(shí)驗(yàn)研究之間搭建起共性分析與特征性分析的橋梁，為三七在中醫(yī)藥精準(zhǔn)醫(yī)療中的地位提供物質(zhì)基礎(chǔ)與研究思路。