響應(yīng)面優(yōu)化北五味子米酒發(fā)酵工藝研究

劉 洋

（長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130033）

北五味子（Schisandra chinesis（Turcz.）Bsill.）產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古等地，因其藥用價(jià)值高，應(yīng)用范圍廣，在國內(nèi)外久負(fù)盛名。其果實(shí)粒大、肉厚、光澤好，有油性，藥用成分高，療效顯著[1]。北五味子果實(shí)中含揮發(fā)油、檸檬酸、蘋果酸、維生素C、維生素E、樹脂、鞣質(zhì)、多種氨基酸及少量糖類物質(zhì)，還含有7種木脂素類化合物，如五味子酯甲、酯乙、醇甲、醇乙、甲素、乙素、丙素等[2-5]，研究表明這些成分多具有鎮(zhèn)靜[6]、鎮(zhèn)痛[7]、鎮(zhèn)咳[8]、延長睡眠時(shí)間[9]等藥理作用，能降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶[10]、抗癌、抗艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、拮抗血小板活化因子和抑制醛糖還原酶等多種活性，并且可以增強(qiáng)人體免疫力等功效等。臨床上主要用于治療失眠、焦慮、慢性肝炎、心臟病、腎虛久咳、降血脂、肺炎抗腫瘤等癥[11-15]。

近年來采用傳統(tǒng)生物發(fā)酵技術(shù)開發(fā)出五味子系列保健食品，包括五味子葡萄酒、啤酒、果醋、酸奶等，但在五味子米酒研究領(lǐng)域?qū)崒倏瞻?。北五味子果漿中富含單糖類、氨基酸、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多種維生素等多種生理活性物質(zhì)及K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Si等礦物質(zhì)元素，能增強(qiáng)五味子發(fā)酵酒香氣及口感；米酒酒香濃郁，香甜醇美，含有8種人體自身不能合成而又必需的氨基酸，其中賴氨酸的含量比葡萄酒要高出數(shù)倍，為世界其他營養(yǎng)酒類中所罕見，具有健脾養(yǎng)胃、補(bǔ)養(yǎng)氣血、舒筋活血、祛風(fēng)除濕的功效，是產(chǎn)婦和老年人的滋補(bǔ)佳品[16]。

吉林省是我國大米的主產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量達(dá)到600多萬t，約占東北大米總產(chǎn)量的24%，而且大米的感官品質(zhì)極佳，晶瑩剔透、香甜軟糯，大米中淀粉含量占75%左右，淀粉作為多糖是釀酒的主要原料，在適宜的發(fā)酵條件下可以分解產(chǎn)生糊精、葡萄糖、麥芽糖等低聚糖，不但可用于酒曲中微生物生長繁殖，還可被霉菌、酵母菌利用產(chǎn)生酒精。延邊大學(xué)的張玲[17]選用大米為主要原料制備米酒，詳細(xì)闡述了制作工藝及操作要點(diǎn)。鑒于應(yīng)用大米制作米酒存在先例并具有可行性，因此，本研究以吉林省農(nóng)產(chǎn)品大米為主要原料釀造五味子米酒，并通過其發(fā)酵工藝優(yōu)化，將五味子功能特性及營養(yǎng)成分引入米酒制作中，形成酸甜可口的特殊風(fēng)味，改善傳統(tǒng)米酒的口感，提高傳統(tǒng)米酒的營養(yǎng)價(jià)值及保健功效，為打造新一代高端功能性飲品提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子（Schisandra chinesis（Turcz.）Bsill.）：吉林省蛟河市；大米：吉林省永吉縣；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；硫酸銅、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LB50T手持糖度計(jì)：深圳市德優(yōu)平科技有限公司；SPM-808智能生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；HH-8型恒溫水浴鍋：常州迅生儀器有限公司；Alcomat Super酒精度測試儀：北京三思智業(yè)科技有限公司；FA系列電子分析天平：上海越平科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子米酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

北五味子果漿制備：9月上旬，選擇果粒飽滿的北五味子鮮果，用清水浸泡洗除表皮污物，加入0.05%的高錳酸鉀消毒，按照料液比1∶1加入水于北五味子果中，經(jīng)高速剪切乳化機(jī)1 000 r/min進(jìn)行打漿處理5 min，過濾渣料，測果漿可溶性固形物含量105℃滅菌15 min后以備用接種[18-19]。

浸米：原料大米凈水洗凈，加入清水浸沒，米和水的比例為1.0∶2.0（g∶mL），將大米放在30 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中，浸米24 h，浸泡達(dá)到米粒外觀由透明變白色，手捏即碎為宜[20]。

拌曲添漿：將浸泡好的大米用蒸鍋蒸煮約45 min，蒸好的大米用約20℃的涼水淋至室溫，瀝干水分后進(jìn)行落缸，加入一定量的甜酒曲，攪拌均勻；加入一定量的北五味子果漿，攪拌均勻；在米飯中央位置挖出一個(gè)倒喇叭狀的窩，以增加米飯與空氣的接觸面積，釋放熱量，便于觀察產(chǎn)酒情況[21]。

糖化發(fā)酵：前期糖化溫度36℃，糖化時(shí)間36～84 h；糖化結(jié)束后，將糖化醪放于20℃條件下保溫發(fā)酵24～60 h。

殺菌保藏：將米酒用發(fā)酵罐密封加熱至75℃左右殺菌15～20min，保溫30s后冷卻，冷卻后即制得北五味子米酒。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

選取北五味子果漿添加量（8%、12%、16%、20%、24%）、酒曲接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、糖化時(shí)間（36h、48 h、60 h、72 h、84 h）、發(fā)酵時(shí)間（32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，糖化溫度為36℃、后發(fā)酵溫度為20℃，分別考察各因素對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響。

1.3.3 北五味子米酒發(fā)酵工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

以北五味子果漿添加量（A）、酒曲接種量（B）、糖化時(shí)間（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為考察因素，以感官評分為評價(jià)指標(biāo)，利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平如表1所示[22]。

表1 北五味子米酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization ofSchisandra chinesis rice wine

1.3.4 測定方法

（1）理化指標(biāo)測定

斐林試劑法測定還原糖（以葡萄糖計(jì)）[23]；酒精計(jì)法測定酒精度[23]；電位滴定法測定總酸[24]。

（2）感官評價(jià)方法

選擇15名感官評定專業(yè)人員組成評定小組，參照NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》對北五味子米酒從色澤（25分）、香氣（35分）、口感（40分）3個(gè)方面進(jìn)行評價(jià)，滿分為100分，具體評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2[25]。

表2 北五味子米酒感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards ofSchisandra chinesis rice wine

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 北五味子果漿添加量對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響

參照上述北五味子米酒發(fā)酵工藝，設(shè)計(jì)北五味子果漿添加量分別為8%、12%、16%、20%、24%，設(shè)置甜酒曲接種量2%、糖化時(shí)間48 h、發(fā)酵時(shí)間48 h，考察北五味子果漿添加量對五味子米酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 北五味子果漿添加量對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響Fig.1 Effect ofSchisandra chinesisfruit pulp addition on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖1可知，當(dāng)北五味子果漿添加量在8%～16%范圍內(nèi)時(shí)，隨著北五味子果漿添加量的增加，米酒中酒精度、還原糖、總酸含量均呈現(xiàn)上升的趨勢，其中酒精度從2.51%vol增加至6.14%vol；還原糖從10.58g/100g增加至24.78g/100g；總酸含量從0.37 g/100 g增加至0.80 g/100 g；當(dāng)北五味子果漿添加量在8%～16%范圍內(nèi)時(shí)，北五味子米酒感官評分隨著五味子果漿添加量的增加而增加，感官評分最高可達(dá)91.1分，此時(shí)米酒中還原糖含量為16.81 g/100 g，酒精度為4.45%vol，總酸為0.65 g/100 g；北五味子果漿添加量在16%～24%范圍內(nèi)時(shí)，北五味子米酒感官評分呈現(xiàn)降低的趨勢；當(dāng)北五味子果漿添加量為24%時(shí)，北五味子米酒感官評分降至70.2分。北五味子果漿本身具有獨(dú)特的酸甜滋味，稍有咸味，與大米一起發(fā)酵，通過緩解高滲透壓對菌種的抑制而提高發(fā)酵速度，增強(qiáng)米酒的香氣，但北五味子果漿添加量過大，增加了甜酒曲的含水量，導(dǎo)致酵母發(fā)酵速度變慢，產(chǎn)酒量減少，米酒風(fēng)味下降，酒體呈現(xiàn)微渾。因此，北五味子果漿最適添加量為16%。

2.1.2 甜酒曲接種量對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響

設(shè)置北五味子果漿添加量為16%，甜酒曲接種量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，設(shè)置糖化時(shí)間48 h、發(fā)酵時(shí)間48 h，考察甜酒曲接種量對北五味子米酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 甜酒曲接種量對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響Fig.2 Effect of sweetJiuquinoculum on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖2可知，隨著甜酒曲接種量的增加，北五味子米酒發(fā)酵液中酒精度與總酸含量逐漸升高，還原糖含量先增高后下降。當(dāng)甜酒曲接種量在1%～2%范圍內(nèi)時(shí)，還原糖含量從14.43 g/100 g增加至29.87 g/100 g，甜酒曲接種量超過2.0%時(shí)，還原糖含量逐漸下降，接種量達(dá)3%時(shí)，最低還原糖含量達(dá)10.23 g/100 g，這是因?yàn)榫N發(fā)酵使糖轉(zhuǎn)化為酒精；所以酒精度保持升高趨勢，酒精度含量過高米酒口感下降，因此當(dāng)甜酒曲接種量為2.5%時(shí)，米酒中還原糖含量為18.52 g/100 g，酒精度為5.80%vol，總酸含量為0.75 g/100 g，此時(shí)米酒的感官評分達(dá)最高為86.4分，甜酒曲接種量達(dá)3.0%時(shí)，米酒口感下降，有明顯的酸澀感，由于甜酒曲接種量增加，發(fā)酵體系急劇升溫，酵母菌大量繁殖，引起酸敗現(xiàn)象，影響米酒澄清度，感官評分降低到73.2分。因此，最適宜甜酒曲接種量為2.5%。

2.1.3 糖化時(shí)間對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響

北五味子果漿添加量為16%，甜酒曲接種量為2.5%，設(shè)置糖化時(shí)間分別為36 h、48 h、60 h、72 h、84 h，發(fā)酵時(shí)間48 h不變，考察糖化時(shí)間對北五味子米酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 糖化時(shí)間對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響Fig.3 Effect of saccharification time on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖3可知，隨著糖化時(shí)間的延長，北五味子米酒中酒精度、還原糖及總酸含量都隨之升高，在糖化時(shí)間達(dá)48 h時(shí)，酒精度達(dá)6.78%vol，還原糖含量達(dá)23.35 g/100 g，總酸含量為0.18 g/100 g，此時(shí)米酒清澈，口感較好，感官評分最高達(dá)88.7分；在糖化時(shí)間48～84 h內(nèi)，酒精生成量上升比較明顯，最高酒精度達(dá)9.74%vol，由于糖化過度使得米粒出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象，酒味也變得更加濃烈，米酒品質(zhì)下降，酒體渾濁，米酒感官評分下降。因此，最適宜糖化時(shí)間為48 h，此時(shí)米酒口感醇厚，風(fēng)味純正，酒體協(xié)調(diào)，澄清度較好。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響

北五味子果漿添加量為16%，甜酒曲接種量為2.5%，糖化時(shí)間48h，設(shè)計(jì)發(fā)酵時(shí)間分別為32h、40h、48h、56h、64h，考察發(fā)酵時(shí)間對北五味子米酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對米酒理化指標(biāo)及感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，米酒中還原糖呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，酒精度及總酸含量逐漸升高，發(fā)酵時(shí)間短，發(fā)酵液中根霉糖化不完全，米酒中還原糖及酒精度均較低，風(fēng)味不顯著；延長發(fā)酵時(shí)間使淀粉被淀粉酶充分分解，發(fā)酵液總糖含量升高，在發(fā)酵時(shí)間達(dá)48 h時(shí)，還原糖含量達(dá)最高為19.90 g/100 g，酒精度為6.19%vol，總酸含量為0.34 g/100 g，此時(shí)酒體清澈、淡淡的酒香味，口感舒爽，感官評分較高達(dá)91.2分。發(fā)酵時(shí)間超過48 h，酵母發(fā)酵載體的底物濃度增大，使酵母對糖的利用度加速，總糖含量明顯下降，整個(gè)發(fā)酵體系代謝過程變緩，菌種衰減，米酒味道酸澀，口感下降，因此，最適宜發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過響應(yīng)面法對北五味子果漿添加量（A）、甜酒曲接種量（B）、糖化時(shí)間（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)因素分析，設(shè)置3個(gè)水平對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 北五味子米酒釀造工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process conditions optimization of Schisandra chinesisrice wine

通過DesignExpert8.0軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到4個(gè)因素的多元回歸方程：Y=+84.28+8.27A+8.18B+10.21C+1.51D+0.88AB-2.83AC+2.65AD+0.98BC+6.25BD+4.47CD-5.17A2-6.42B2-8.44C2-6.86D2。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續(xù)表

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 0.84 0.11 4.67 2.39 5.19 8.00 13.79 9.12 0.375 1 0.741 1 0.048 5 0.144 2 0.039 0 0.013 4 0.002 3 0.009 2不顯著不顯著顯著不顯著顯著顯著極顯著極顯著殘差失擬項(xiàng)純誤差總離差28.09 3.80 156.25 80.10 173.60 267.63 461.60 305.33 486.60 372.95 95.65 4 465.05 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 10 4 28 28.09 3.80 156.25 80.10 173.60 267.63 461.60 305.33 33.47 37.30 23.91 1.560.354 8不顯著

根據(jù)表4方差分析結(jié)果可知，北五味子米酒感官評分的回歸方程與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系模型顯著（P＜0.05），并且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ统浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，即可以利用此感官評分的回歸方程確定北五味子米酒發(fā)酵的最佳工藝。

多元回歸方程一次項(xiàng)D和交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、CD對北五味子米酒感官評分沒有顯著性影響（P＞0.05），交互項(xiàng)BD、A2、B2對北五味子米酒感官評分表現(xiàn)出顯著的影響（P＜0.05），其中一次項(xiàng)A、B、C與二次項(xiàng)C2、D2對北五味子米酒感官評分影響為極顯著（P＜0.01），這表明四個(gè)試驗(yàn)因素對五味子米酒響應(yīng)值感官評分的影響不是單純的線性關(guān)系，而是表現(xiàn)為二次關(guān)系。

各因素對北五味子米酒感官品質(zhì)的響應(yīng)面結(jié)果見圖5。由圖5可知，甜酒曲接種量與發(fā)酵時(shí)間之間的交互作用對感官評分影響顯著（P＜0.05），與表4方差分析結(jié)果相吻合。隨著甜酒曲接種量的逐漸增加，造成發(fā)酵液酒精體積分?jǐn)?shù)偏高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液酒精中糖分不斷轉(zhuǎn)換成乙醇和香氣物質(zhì)，導(dǎo)致感官評分分?jǐn)?shù)偏高。北五味子果漿添加量、甜酒曲接種量、糖化時(shí)間三者對北五味子米酒感官評分的影響均較大，按主次順序排列為糖化時(shí)間＞北五味子果漿添加量＞甜酒曲接種量＞發(fā)酵時(shí)間；與表4方差分析結(jié)果相吻合。

圖5 北五味子果漿添加量、甜酒曲接種量、糖化時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間交互作用對五味子米酒感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction betweenSchisandra chinesisfruit pulp addition,sweetJiuquinoculum,saccharification time and fermentation time on the sensory evaluation score ofSchisandra chinesisrice wine

2.3 優(yōu)化條件的確定和模型驗(yàn)證

通過軟件分析確定北五味子米酒最佳發(fā)酵工藝為北五味子果漿添加量為16.28%、甜酒曲接種量為2.15%、糖化時(shí)間為48.86 h、發(fā)酵時(shí)間47.64 h，北五味子米酒感官評分預(yù)測值為92.43分。為方便實(shí)際操作，根據(jù)3組驗(yàn)證試驗(yàn)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整后北五味子果漿添加量16.3%、甜酒曲接種量為2.2%，糖化時(shí)間48.9 h，發(fā)酵時(shí)間47.6 h；采用此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到北五味子米酒的感官評分為93.3分，實(shí)測值與預(yù)測值相對誤差為0.9%，表明該預(yù)測結(jié)果與真實(shí)試驗(yàn)情況較符合，具有一定的參考價(jià)值。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化五味子米酒理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

在北五味子米酒最佳發(fā)酵工藝條件下測定還原糖含量為11.94 g/100 g；酒精度為6.75%vol；總酸為0.86 g/100 g。北五味子米酒中微生物菌落總數(shù)34 CFU/g；大腸菌群1.87 MPN/100 g，未檢出其他致病菌。理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果符合NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》要求[26]。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面分析法對五味子米酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，影響北五味子米酒感官評分的工藝因素按主次順序排列為糖化時(shí)間＞北五味子果漿添加量＞甜酒曲接種量＞發(fā)酵時(shí)間。最終確定北五味子米酒最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為北五味子果漿添加量16.3%、甜酒曲接種量為2.2%、糖化時(shí)間48.9 h、發(fā)酵時(shí)間47.6 h，采用此工藝釀造的北五味子米酒感官評分為93.3分。北五味子米酒湯色呈現(xiàn)棕褐色，清澈透明，有典型的米酒發(fā)酵香，酒味醇厚，入口甜美，營養(yǎng)豐富。米酒理化及微生物指標(biāo)滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。