青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化

魯 青，張超鳳，嚴(yán)美婷，張 良

（江西省食品發(fā)酵研究所，江西 宜春 336000）

青錢(qián)柳（Cyclocarya paliurus）是我國(guó)特有的珍稀植物，藥食同源，因具有降血糖、降血壓等功效而有“神茶”之譽(yù)[1]，并于2013年被收錄在新資源食品目錄[2]，安全無(wú)毒使其作為普通的食品食用[3]，據(jù)現(xiàn)代藥理研究證明其含有的黃酮具有明顯的降血糖、抗氧化功效[4-5]，若是能將其加工制得日常低糖飲品，符合現(xiàn)代人對(duì)健康綠色食品的需求[6]。但是青錢(qián)柳特有的苦澀味使得直接加工的產(chǎn)品的適口性較差，不適合大眾消費(fèi)。有研究表明通過(guò)發(fā)酵工藝可去除青錢(qián)柳的苦澀味以改善風(fēng)味[7]，但是在發(fā)酵過(guò)程中需要添加大量的糖類(lèi)作為益生菌發(fā)酵的碳源，不符合現(xiàn)在大眾的低糖消費(fèi)觀。葛根為豆科植物野葛的干燥根，其活性成分異黃酮的干基含量為0.5%～5.0%[8-9]，其具有降血壓、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、防治骨質(zhì)疏松等功效[10-15]，同時(shí)葛根中含有大量的優(yōu)質(zhì)淀粉，淀粉含量約為葛根的20%～40%，其中直鏈淀粉占21%[16]。但是目前對(duì)葛根的利用還只是提取總黃酮或淀粉，對(duì)葛根的綜合利用率不高[17]，若能將其淀粉水解為糖類(lèi)，作為益生菌發(fā)酵的碳源，既提高了葛根的利用率，又可降低產(chǎn)品中的含糖量。

本試驗(yàn)利用α-淀粉酶和糖化酶水解葛根，使得淀粉水解為葡萄糖等糖類(lèi)，制得葛根汁，然后與青錢(qián)柳液以一定的比例混合，采用分步發(fā)酵法，優(yōu)化青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料發(fā)酵工藝，研制出含糖量低、酸甜適口的具有一定保健功能的發(fā)酵型飲料，為低糖型飲料的開(kāi)發(fā)和青錢(qián)柳及葛根的開(kāi)發(fā)利用提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

青錢(qián)柳：江西修水；葛根、白砂糖：市售；酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillusplantarum subsp.plantarum）：江西省食品發(fā)酵研究所。

1.1.2化學(xué)試劑

α-淀粉酶（1萬(wàn)U/g）：邢臺(tái)萬(wàn)達(dá)生物工程有限公司；糖化酶（5萬(wàn)U/g）：博立生物制品有限公司；纖維素酶（10萬(wàn)U/g）：和氏璧生物科技有限公司；半纖維素酶（10萬(wàn)U/g）：浙江一諾生物科技有限公司；蘆丁（純度＞98%）：酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0±0.2，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L；酵母膏5g/L；檸檬酸氫二銨2 g/L；葡萄糖20 g/L；吐溫-80 1 mL；乙酸鈉5 g/L；磷酸氫二鉀2 g/L；硫酸鎂0.58 g/L；pH 6.4±0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-G12E破壁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；HHS21-6恒溫水浴鍋：江蘇金壇市瑞華儀器有限公司；WAY-Z自動(dòng)阿貝折光儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；ML204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SP-756PC分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；1 000 μL移液槍?zhuān)荷虾s泰生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料加工工藝流程

青錢(qián)柳葉和葛根的預(yù)處理→青錢(qián)柳液和葛根汁混合→調(diào)糖→一次滅菌→接種酵母→一次發(fā)酵→二次滅菌→接種植物乳桿菌植物亞種→二次發(fā)酵→三次滅菌→成品1.3.2操作要點(diǎn)

（1）青錢(qián)柳液的制備

將青錢(qián)柳葉清洗干凈，與水以料液比1∶1（g∶mL）混合打漿，加熱至60℃，加入纖維素酶和半纖維素酶保溫酶解3 h，每隔15 min攪拌一次，冷卻，先紗布后定性濾紙過(guò)濾，濾液冷藏備用。

（2）葛根汁的制備

將葛根清洗干凈切塊，與水以料液比1∶2（g∶mL）混合打漿，加熱至85℃后保溫糊化30 min；加入α-淀粉酶在85℃條件下液化約2 h使淀粉完全液化（碘試反應(yīng)呈棕紅色），每隔15 min攪拌一次；將液化完全的葛根升溫至100℃保持5 min滅酶，隨后降溫至60℃并保持，加入糖化酶攪拌并保溫2 h，使其充分糖化；紗布過(guò)濾，濾液冷藏備用。

（3）調(diào)糖

青錢(qián)柳液與葛根汁以一定的比例混合后，添加白砂糖使其糖度達(dá)到18°Bx，121℃滅菌15 min，即得發(fā)酵原液。

（4）一次滅菌

90℃滅菌15min，以保證酵母純種發(fā)酵。

（5）種子液的培養(yǎng)

酵母的活化：將2環(huán)酵母接種至10 mLYPD培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24h，然后將其接種至100mLYPD培養(yǎng)基中，25℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，即得酵母種子液[18]。

植物乳桿菌植物亞種的活化：取兩環(huán)植物乳桿菌植物亞種，接種至100 mLMRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 d，即得植物乳桿菌植物亞種種子液。

（6）一次發(fā)酵

接種一定量的酵母至發(fā)酵原液，于30℃發(fā)酵條件下發(fā)酵一定時(shí)間后，得一次發(fā)酵液。

（7）二次滅菌

一次發(fā)酵液在90℃條件下滅菌15 min，保證后續(xù)植物乳桿菌植物亞種純種發(fā)酵。

（8）二次發(fā)酵

接種植物乳桿菌植物亞種至一次發(fā)酵液，于37℃發(fā)酵條件下發(fā)酵一定時(shí)間后，得到二次發(fā)酵液。

（9）三次滅菌

二次發(fā)酵液在90℃條件下滅菌15 min，得成品。

1.3.3 青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)以青錢(qián)柳液與葛根汁體積比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）、一次發(fā)酵酵母接種量（0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%）、一次發(fā)酵時(shí)間（16 h、20 h、24h、28h、32h）、二次發(fā)酵植物乳桿菌植物亞種接種量（1%、2%、3%、4%、5%）和 二次發(fā)酵時(shí)間（16 h、20 h、24 h、28 h、32 h）為考察因素，以總黃酮含量和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.3.4 青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以青錢(qián)柳液與葛根汁比例（A）、酵母接種量（B）、一次發(fā)酵時(shí)間（C）和植物乳桿菌植物亞種接種量（D）為考察因素，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，以確定最佳的發(fā)酵工藝，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization ofCyclocarya paliurus-Radix Pueariae compound fermented beverage

1.3.5 分析檢驗(yàn)

（1）總黃酮含量的測(cè)定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：參考文獻(xiàn)[19]以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

樣品中總黃酮的提取及含量測(cè)定：稱(chēng)取滅菌后的發(fā)酵液2.0g，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇搖勻，微波加熱70 s，冷卻至室溫后抽濾，將濾液用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇定容至100mL，避光保存為待測(cè)液。取待測(cè)液3mL于10mL容量瓶中，參照蘆丁處理方法處理待測(cè)液，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

（2）感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

邀請(qǐng)20名具有感官評(píng)定能力的人員，對(duì)發(fā)酵所得的飲料進(jìn)行感官評(píng)分，滿(mǎn)分100分，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards ofCyclocarya paliurus-Radix Pueariae compound fermented beverage

（3）理化指標(biāo)測(cè)定

酒精度：按照國(guó)標(biāo)GB/T 13662—2018《黃酒》中的蒸餾比重法；總酸（以乳酸計(jì)）：按照國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的pH電位法；pH值：pH計(jì)測(cè)定；糖度：自動(dòng)阿貝折光儀測(cè)定。

（4）微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群及致病菌（沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌）按照國(guó)標(biāo)GB/T 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲料》中的規(guī)定執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of rutin

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y=9.857 9x+0.009 4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，表明二者線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

圖2 青錢(qián)柳液與葛根汁比例對(duì)復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Fig.2 Effect ofCyclocarya paliurusliquid and Radix Pueariae juice ratio on the quality of compound fermented beverage

2.2.1 青錢(qián)柳液與葛根汁比例的確定由圖2可知，隨著青錢(qián)柳液比例的增加，復(fù)合發(fā)酵飲料中的總黃酮含量也隨之升高，當(dāng)青錢(qián)柳液與葛根汁體積比為2∶1時(shí)，復(fù)合發(fā)酵飲料中的總黃酮含量達(dá)到最高為6.417 mg/g，這是因?yàn)榍噱X(qián)柳總黃酮含量高于葛根[20-21]；感官評(píng)分隨著青錢(qián)柳液比例的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)青錢(qián)柳液與葛根汁體積比為2∶1時(shí)，在這個(gè)比例條件下發(fā)酵的飲料感官評(píng)分最高，為87分。因此，最佳的青錢(qián)柳液與葛根汁體積比為2∶1。

2.2.2 一次發(fā)酵酵母接種量的確定

圖3 酵母接種量對(duì)復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of compound fermented beverage

由圖3可知，當(dāng)酵母的接種量為0.10%～0.50%時(shí)，隨著酵母接種量的增加，總黃酮含量與感官評(píng)分都隨之增加，這是因?yàn)殡S著酵母接種量的增加，產(chǎn)生的酒精也在增加，為此總黃酮的提取率隨之增加[22]，同時(shí)酵母在發(fā)酵過(guò)程中可以除去青錢(qián)柳的澀味，為此感官評(píng)分也在增加；當(dāng)酵母的接種量為0.50%時(shí)，總黃酮含量與感官評(píng)分均達(dá)到最高，分別為為6.557 mg/g和88分；當(dāng)酵母的接種量為0.50%～0.60%時(shí)，隨著酵母接種量的增加，總黃酮含量幾乎不變，而感官評(píng)分隨之降低，這是因?yàn)殡S著酵母接種量越大，大部分糖轉(zhuǎn)化為酒精使得酒精味過(guò)重和酸甜不調(diào)和。因此，確定最佳的酵母接種量為0.50%。

2.2.3 一次發(fā)酵時(shí)間的確定

圖4 一次發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of first fermentation time on the quality of compound fermented beverage

由圖4可知，一次發(fā)酵時(shí)間為16～24 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，總黃酮含量與感官評(píng)分均隨之增加；一次發(fā)酵時(shí)間為24～32 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量幾乎不變，但感官評(píng)分隨之下降，原因可能是因?yàn)榇罅康奶潜环纸馐沟弥参锶闂U菌植物亞種后續(xù)發(fā)酵幾乎無(wú)碳源，不利于乳酸發(fā)酵導(dǎo)致產(chǎn)生的乳酸少，進(jìn)而使得飲料酸甜不協(xié)調(diào)；一次發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，總黃酮含量與感官評(píng)分分別為6.449mg/g和90分。因此，確定最佳一次發(fā)酵時(shí)間為24h。

2.2.4 二次發(fā)酵植物乳桿菌植物亞種接種量的確定

圖5 植物乳桿菌植物亞種接種量對(duì)復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Fig.5 Effect ofLactobacillus plantarumsubsp.plantaruminoculum on the quality of compound fermented beverage

由圖5可知，植物乳桿菌植物亞種的接種量為1%～5%時(shí)，復(fù)合發(fā)酵飲料中的總黃酮含量幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明總

黃酮含量的變化主要與酵母的發(fā)酵有關(guān)；當(dāng)植物乳桿菌植物亞種的接種量為1%～3%時(shí)，感官評(píng)分隨著接種量的增加而升高，當(dāng)植物乳桿菌植物亞種的接種量為3%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，為90分；隨后隨著植物乳桿菌植物亞種接種量的增加，感官評(píng)分呈穩(wěn)定趨勢(shì)。因此，確定最佳的植物乳桿菌植物亞種接種量為3%。

2.2.5 二次發(fā)酵時(shí)間的確定

圖6 二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of second fermentation time on the quality of compound fermented beverage

由圖6可知，植物乳桿菌植物亞種發(fā)酵時(shí)間為12～16 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加復(fù)合發(fā)酵飲料中的總黃酮含量和感官評(píng)分均均隨之增加，這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌植物亞種發(fā)酵前期產(chǎn)生的酶促進(jìn)黃酮的合成[23]，植物乳桿菌植物亞種發(fā)酵產(chǎn)生大量有機(jī)酸賦予產(chǎn)品柔和的口感；植物乳桿菌植物亞種發(fā)酵時(shí)間為12～16 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加復(fù)合發(fā)酵飲料中的總黃酮含量和感官評(píng)分均無(wú)明顯的變化，為此選定二次發(fā)酵時(shí)間為16 h。

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察青錢(qián)柳液與葛根汁比例、酵母接種量、一次發(fā)酵時(shí)間和植物乳桿菌植物亞種接種量這4個(gè)因素對(duì)青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料的影響，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，考慮飲料的適口性，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料二次發(fā)酵的最佳工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3。

由表3可知，通過(guò)極差分析可知4個(gè)因素對(duì)青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料的影響大小依次為C＞A＞D＞B，即一次發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料的感官品質(zhì)影響最大，青錢(qián)柳液與葛根汁體積比次之，酵母的接種量影響最小。青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料最佳發(fā)酵工藝組合為A1B2C2D3，即青錢(qián)柳液與葛根汁體積比為1∶1，酵母接種量為0.5%，一次發(fā)酵時(shí)間為24 h，植物乳桿菌植物亞種的接種量為3.5%。在此最佳工藝條件下，生產(chǎn)的青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料感官評(píng)分為91分。在此最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分為91.7分。

表3 青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization ofCyclocarya paliurus-Radix Pueariae compound fermented beverage

2.4 青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料的品質(zhì)分析

感官指標(biāo)：具有青錢(qián)柳和葛根的清香味，口感柔和，酸甜適口。理化指標(biāo)：酒精度為0.2%vol，總酸為2.49g/L，糖度為8.3 °Bx，pH值為3.58。微生物指標(biāo)：細(xì)菌總數(shù)＜50CFU/mL，大腸菌群＜2 MPN/100 mL，致病菌未檢出。青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料的品質(zhì)指標(biāo)滿(mǎn)足相關(guān)國(guó)標(biāo)要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以青錢(qián)柳液和經(jīng)α-淀粉酶和糖化酶水解的葛根汁為原料，利用酵母和植物乳桿菌植物亞種先后發(fā)酵制備青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料。青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料的最佳發(fā)酵工藝條件為：青錢(qián)柳液與葛根汁體積比1∶1，酵母接種量0.50%，一次發(fā)酵時(shí)間24 h，植物乳桿菌植物亞種的接種量3.5%，二次發(fā)酵時(shí)間16 h。在此優(yōu)化條件下，青錢(qián)柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料具有青錢(qián)柳和葛根的清香味，口感柔和，酸甜適口，感官評(píng)分達(dá)91.7分，酒精度為0.2%vol，總酸為2.49 g/L，糖度為8.3 °Bx，pH值為3.58，總黃酮含量達(dá)5.15 mg/g。