狗尾草多酚的提取工藝及抗氧化活性研究

段笑影，曹冬冬，崔 強(qiáng)，陸徐偉，李 文，王虹玲*

（沈陽工學(xué)院 生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122）

中藥材狗尾草（Setaria viridis）為禾本科植物狗尾草屬多種植物的總稱又名綠狗尾草、谷莠子[1]。狗尾草中富含多糖和酚類物質(zhì)，并含有鈣、磷、鎂、鉀、鈉、硫、氯等元素，其種子粒中含有48%～50%的淀粉[2-5]。狗尾草性平、味淡、無毒，具有清熱利濕、祛風(fēng)明目、解毒、殺蟲等功效，可治療癰腫、瘡癬、赤眼等[6-8]。多酚類物質(zhì)是植物的主要次生代謝產(chǎn)物之一，多酚通過提供氫原子或螯合劑來抑制氧化作用，使其具有較強(qiáng)的抗氧化能力和清除自由基能力[9-11]，且研究證實(shí)多酚類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗血栓形成和抗動(dòng)脈硬化等重要作用。

目前國內(nèi)對(duì)狗尾草屬的研究主要集中于狗尾草種子活力及其萌發(fā)特性，國外狗尾草中活性物質(zhì)提取的研究較少。楊楠等[12]利用正交試驗(yàn)對(duì)狗尾草中總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取，得到狗尾草中總黃酮類物質(zhì)最大提取率為2.20%。

本研究以成熟狗尾草為原料，乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取狗尾草中的多酚，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定狗尾草中提取多酚的最佳提取條件，并對(duì)狗尾草多酚的體外抗氧化性進(jìn)行探討，旨為狗尾草的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

狗尾草：于2018年10月采摘于沈陽工學(xué)院，新鮮，無病蟲害，烘干磨粉后備用。

1.1.2 藥品試劑

沒食子酸：武漢鼎國生物技術(shù)有限公司；乙醇、無水碳酸鈉、福林酚（folin phenol，F(xiàn)C）試劑、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylatedhydroxytoluene，BHT）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250E醫(yī)用超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1800紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XS-255A精密電子天平：普利賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；HC-500T2高速多功能粉碎機(jī)：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；TGL-18B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；GM0.33A隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DGG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 狗尾草中多酚的提取工藝流程

狗尾草種子烘干→去除雜質(zhì)→粉碎過60目篩→加入乙醇→超聲輔助提?。üβ?50 W）→真空抽濾→蒸發(fā)濃縮→多酚

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[13]

準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.011 g用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度0.11 mg/mL；精確移取0、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于25 mL棕色容量瓶中，分別添加蒸餾水至6.0 mL，然后分別加入福林酚試劑0.5 mL，混勻后加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，充分混勻后定容至刻度，30℃避光放置0.5 h，在波長760 nm處測定其吸光度值，同時(shí)用試劑空白為參比液。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 狗尾草提取液中的多酚含量測定

取1.0mL狗尾草提取液按照1.3.2中的方法于波長760nm處測其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出1.0 mL中樣品的多酚含量，按下式計(jì)算得到多酚提取率。

式中：X為多酚提取率，%；m1為1.0 mL提取液中的多酚含量，mg/mL；V1為提取液的總體積，mL；M1為稱取的狗尾草粉末質(zhì)量，g。

1.3.4 狗尾草提取液工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

采用超聲波輔助乙醇法，考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)狗尾草中多酚提取率的影響。

精確稱取5.0 g狗尾草干粉末，置于100 mL燒杯中。分別在不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL）），乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%、60%、65%、70%、75%、80%），提取溫度（55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃），提取時(shí)間（70 min、75 min、80 min、85 min、90 min、95 min）條件下進(jìn)行提取，取1 mL提取液，在波長760 nm處測其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其多酚含量。

1.3.5 狗尾草多酚提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以多酚提取率（Y）為考察指標(biāo)，以料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14-17]，優(yōu)化狗尾草中多酚類物質(zhì)的提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 狗尾草多酚提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for extraction conditions optimization of polyphenols from Setaria viridis

1.3.6 抗氧化活性測定

（1）羥基自由基（OH·）清除率

按照參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行測定。以BHT作陽性對(duì)照，重復(fù)測定3次取平均值。OH·清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為空白對(duì)照組吸光度值；A2為樣品組吸光度值；A3為蒸餾水代替水楊酸的溶液的吸光度值。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除測定

按照參考文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行測定。以BHT作陽性對(duì)照，重復(fù)測定3次取平均值。O2-·清除率計(jì)算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率=A0-A1+A2

A0×100%

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度值；A1為樣品組吸光度值；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚的溶液的吸光度值。

（3）DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定

按照參考文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行測定。以BHT作陽性對(duì)照，重復(fù)測量3次取平均值。DPPH·清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為樣品組吸光度值；A2為無水乙醇代替DPPH的溶液的吸光度值；A3為空白對(duì)照組吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以焦性沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.443 9x+0.021 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 6。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)多酚提取率的影響

圖2 料液比對(duì)狗尾草多酚提取率的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖2可知，隨著料液比在1∶15～1∶25（g∶mL）的范圍內(nèi)增大，多酚提取率提高；當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g∶mL）時(shí)，多酚提取率達(dá)到2.66%；繼續(xù)增大料液比時(shí)，多酚提取率提高不顯著；原因可能是開始時(shí)溶劑用量增加促進(jìn)多酚的提取，當(dāng)溶劑用量達(dá)到某一數(shù)值，增加溶劑用量相同的提取時(shí)間內(nèi)提取效果提高不顯著。因此，選取最佳料液比為1∶25（g∶mL）。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)狗尾草多酚提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)在55%～70%范圍內(nèi)的增加，多酚提取率提高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，多酚提取率達(dá)到3.34%；再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，多酚提取率降低；原因可能是不同乙醇體積分?jǐn)?shù)極性不同，且多酚化合物極性較高，根據(jù)相似相溶原理，多酚在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)溶出效率最高。因此，選取最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.3 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)狗尾草多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖4可知，隨著提取溫度在60～75℃范圍內(nèi)的升高，多酚提取率提高；當(dāng)提取溫度達(dá)到75℃時(shí)，多酚提取率達(dá)到3.21%；隨著提取溫度繼續(xù)升高，多酚提取率降低；原因可能是多酚提取率隨著溫度升高而增加，但是溫度過高，多酚結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率降低。因此選取最佳提取溫度為75℃。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)狗尾草多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

由圖5可知，隨著提取時(shí)間在70～80min范圍內(nèi)的增加，多酚提取率提高；當(dāng)提取時(shí)間為80 min時(shí)，多酚提取率達(dá)到2.54%；提取時(shí)間繼續(xù)增加，多酚提取率降低；原因可能是當(dāng)提取時(shí)間過短時(shí)，多酚提取不完全，提取時(shí)間過長時(shí)，多酚的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致多酚提取率降低。因此選取最佳提取時(shí)間為80 min。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2，回歸方程方差分析的結(jié)果見表3。

根據(jù)Design Expert 8.0.6.1對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行的多元回歸擬合，得到以多酚提取率為響應(yīng)值的回歸方程：

Y=3.51-0.049A+0.077B+0.035C+0.038D+0.25AB+0.023AC-0.033AD+0.15BC+0.13BD-0.15CD-0.38A2-0.27B2-0.38C2-0.26D2

表2 狗尾草多酚提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for extraction conditions optimization of polyphenols from Setaria viridis

由表3可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）；回歸方程調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.969 0，決定系數(shù)R2=0.919 8，表明該模型擬合程度較好。在所取的各因素水平范圍內(nèi)，影響狗尾草多酚提取率因素主次順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度，交互項(xiàng)AB、BC、BD、CD 極顯著（P＜0.001）；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)狗尾草多酚提取率均有極顯著影響（P＜0.001）。

2.3.2 響應(yīng)面分析及最佳提取工藝研究

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖6 料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間交互作用對(duì)狗尾草多酚提取率影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between solid to liquid ratio,ethanol volume fraction,extraction temperature and time on extraction rate of polyphenols fromSetaria viridis

響應(yīng)面可直觀反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，曲面越陡說明相關(guān)因素之間的交互作用越強(qiáng)[21]。從圖6可以看出，各因素大小從四周逐漸趨向中心點(diǎn)時(shí)，曲面圖呈凸起趨勢(shì)，即多酚提取率趨向最大化，說明存在最大響應(yīng)值。運(yùn)用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，當(dāng)理論響應(yīng)值最大時(shí)，4個(gè)因素所對(duì)應(yīng)的最佳值為料液比1∶20.11（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)69.73%、提取溫度79.90℃、提取時(shí)間75.21min時(shí)，在此條件下多酚提取率可達(dá)3.499%。

為方便操作，修改最佳條件為料液比1∶20（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80℃、提取時(shí)間75 min，對(duì)狗尾草多酚提取率進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果顯示多酚提取率平均值為3.234%。該實(shí)際值與理論值相近，因此利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝條件具有可行性。

2.4 狗尾草多酚的體外抗氧化活性

2.4.1 對(duì)羥基自由基的清除作用

圖7 狗尾草多酚對(duì)羥基自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of polyphenols fromSetaria viridison hydroxyl free radicals

由圖7可知，隨著狗尾草多酚和BHT質(zhì)量濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率均逐漸增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，BHT、狗尾草多酚對(duì)羥基自由基的清除率分別為（82.70±4.526）%、（48.56±3.457）%。

2.4.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖8 狗尾草多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect of polyphenols fromSetaria viridison DPPH radicals

由圖8可知，隨著狗尾草多酚和BHT質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率均逐漸增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4mg/mL時(shí)，其清除率分別為（65.34±4.190）%和（64.20±4.778）%。

2.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

圖9 狗尾草多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig.9 Scavenging effect of polyphenols fromSetaria viridison superoxide anion radical

由圖9可知，低濃度時(shí)（＜0.4 mg/mL），BHT清除超氧陰離子自由基能力高于狗尾草多酚的清除能力。當(dāng)質(zhì)量濃度＞0.8 mg/mL以后，狗尾草多酚清除率趨于穩(wěn)定，清除率最大值為（88.05±2.954）%；BHT對(duì)超氧陰離子的清除率逐漸增大，最大值為（66.93±4.229）%。

3 結(jié)論

本研究以狗尾草為原料提取多酚，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，以提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面回歸方程確定狗尾草多酚提取工藝的最優(yōu)條件為：料液比1∶20（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80℃、提取時(shí)間75 min，在此條件下，狗尾草多酚提取率為3.234%，與理論值3.499%基本一致。影響狗尾草多酚提取率大小的因素順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，狗尾草多酚可以有效的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到試驗(yàn)最大濃度時(shí)，清除率分別為（48.56±3.457）%、（88.05±2.954）%、（65.34±4.190）%，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。