慢病毒介導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體過(guò)表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

李 泮，袁 方，李二威，李付廣

(1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450001；2.阜外華中心血管病醫(yī)院輸血科，河南 鄭州 450018)

食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，其早中期時(shí)有治愈可能，晚期治愈難度較大，目前主要治療方法包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等。近年來(lái)隨著靶向治療等生物治療手段的豐富和診療技術(shù)的提高，食管癌患者的治療效果和生存率有了一定提高。

近年來(lái)，慢病毒載體已被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的研究，其可以將外源基因有效整合到宿主染色體上，具有持久穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)[1]。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因雙家族的一員，通過(guò)與細(xì)胞膜表面受體特異性結(jié)合可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡[2]。目前關(guān)于慢病毒介導(dǎo)的TRAIL過(guò)表達(dá)在食管癌中的作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建重組慢病毒plenti-TRAIL來(lái)探討TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為進(jìn)一步研究TRAIL在食管癌中的作用機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)食管癌Eca-109細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。將Eca-109細(xì)胞接種于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及青霉素100 u·mL-1和鏈霉素100 g·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 TRAIL片段制備按照天根核糖核酸(RNA)simple總RNA提取試劑盒流程對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，利用該cDNA為模板對(duì)TRAIL進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，并對(duì)TRAIL片段進(jìn)行EcoR I和Not I酶切。

1.3 構(gòu)建重組慢病毒首先膠回收均經(jīng)過(guò)EcoR I和Not I酶切后的TRAIL片段和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP線性載體，對(duì)2個(gè)片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落進(jìn)行鑒定后，提取質(zhì)粒，獲得plenti-TRAIL重組慢病毒表達(dá)載體。

1.4 重組慢病毒包裝和滴定將293T細(xì)胞以3×106個(gè)細(xì)胞/皿傳至10 cm平皿。次日待長(zhǎng)至90%貼壁率時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑，共轉(zhuǎn)染18 h后，適量磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，并更換為10 mL完全DMEM培養(yǎng)基。共轉(zhuǎn)染72 h后，收集病毒培養(yǎng)基，15 mL無(wú)菌離心管中3 000 r·min-1離心5 min，0.45 μm濾器過(guò)濾，再25 000 r·min-1、4 ℃超速離心90 min后，棄上清。無(wú)菌操作，加入病毒原液體積1%的DMEM培養(yǎng)基，每隔15 min輕輕吹打1次，使慢病毒顆粒重懸，使病毒顆粒徹底懸浮。分裝后，-80 ℃凍存?zhèn)溆?，然后進(jìn)行滴度測(cè)定。將重組慢病毒命名為L(zhǎng)V-TRAIL。

1.5 慢病毒感染效率測(cè)定將Eca-109細(xì)胞以1×105/孔的細(xì)胞密度接種于24孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用正常培養(yǎng)基梯度稀釋病毒液105～108IU·mL-1，并梯度感染細(xì)胞。每孔加入8 μg·mL-1的多聚季銨。37 ℃感染2 h，期間每20 min晃動(dòng)平板，使病毒充分感染細(xì)胞。1 000 r·min-1，10 min，水平離心平板，輕輕棄去培養(yǎng)基，添加含體積分?jǐn)?shù)2%血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。4 d后觀察熒光表達(dá)情況，計(jì)算感染效率。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞在6孔板中轉(zhuǎn)染48 h后，接種在96孔板中，細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)3個(gè)平行孔，37 ℃，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，混勻，酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)=570 nm)測(cè)定吸光度(A570)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的影響將細(xì)胞接種在6孔板中，細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)/mL，培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，1 500 r·min-1離心5 min，PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.4)洗1次，按照流式凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V/PE和10 μL 7-ADD，輕輕混勻，避光室溫孵育反應(yīng)10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)。

1.8 Transwell檢測(cè)TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞侵襲的影響首先將凍存于-80 ℃的Matrigel放于4 ℃條件下過(guò)夜，變成液態(tài)；取300 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，加入60 μL Matrigel，混勻，在上室加入100 μL混合液，常規(guī)培養(yǎng)4～5 h；之后消化細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，并配成細(xì)胞懸液；用無(wú)血清培養(yǎng)基洗Matrigel 1次，每孔中加入100 μL細(xì)胞懸液；下室中加入500 μL含有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清培養(yǎng)基；37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育20～24 h；取出Transwell用PBS洗2次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%戊二醛固定，放于4 ℃；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%結(jié)晶紫染色，室溫下放置30 min后，用PBS洗2次，擦去上表面細(xì)胞，放于顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒滴度測(cè)定將目的慢病毒載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收集病毒，然后經(jīng)濃縮后進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，經(jīng)測(cè)定LV-TRAIL病毒滴定值為2×108TU·mL-1。

2.2 重組慢病度感染效率測(cè)定用LV-TRAIL慢病毒感染Eca-109細(xì)胞，觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞有綠色熒光表現(xiàn)，計(jì)算所得感染效率為90%。

2.3 TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的影響利用MTT法檢測(cè)TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的影響，對(duì)照組細(xì)胞24 h、48 h、72 h的光密度(OD)值分別為0.632±0.057、0.949±0.071、1.679±0.162，TRAIL過(guò)表達(dá)組細(xì)胞24 h、48 h、72 h的OD值分別為0.476±0.049、0.716±0.034、0.952±0.091，說(shuō)明TRAIL過(guò)表達(dá)明顯抑制Eca-109細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT檢測(cè)各組Eca-109細(xì)胞的增殖情況

2.4 TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的影響利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)照組和TRAIL過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率分別為4.5%和13.8%，表明TRAIL過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)Eca-109細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組Eca-109細(xì)胞的凋亡情況

2.5 TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞侵襲的影響利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞侵襲的影響，對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)為15.0±1.5，TRAIL過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)為51.0±5.2，說(shuō)明TRAIL過(guò)表達(dá)明顯抑制Eca-109細(xì)胞的侵襲。見(jiàn)圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組Eca-109細(xì)胞的侵襲情況

3 討論

TRAIL能特異性殺傷培養(yǎng)和異種移植腫瘤中的多種腫瘤細(xì)胞，但對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用很小，甚至沒(méi)有影響，因此其是腫瘤治療的理想靶標(biāo)分子。TRAIL是一種有效的凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞因子[3-4]。TRAIL不僅對(duì)結(jié)腸癌[5]、肺癌[6]、腎癌[7]、肝癌[8]等多種實(shí)體瘤細(xì)胞具有促凋亡作用，而且也可以誘導(dǎo)包括白血病在內(nèi)的血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的凋亡[9]。TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與TRAIL和膜受體TRAIL-r1、TRAIL-r2相互作用有關(guān)。這種相互作用導(dǎo)致受體分子FAS-相關(guān)蛋白與死亡域結(jié)合，導(dǎo)致啟動(dòng)子caspase-8的積累，進(jìn)而激活效應(yīng)因子caspase，如caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡[10]。有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，TRAIL在食管癌中表達(dá)下調(diào)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，TRAIL過(guò)表達(dá)能夠明顯促進(jìn)Eca-109細(xì)胞的凋亡。

除了促進(jìn)凋亡外，本研究還發(fā)現(xiàn)TRAIL過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制Eca-109細(xì)胞的增殖和侵襲。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，有很多關(guān)于TRAIL可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的研究。楊陽(yáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL聯(lián)合化療或熱療可以抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的體外增殖；王才智等[14]研究發(fā)現(xiàn)TRAIL聯(lián)合低濃度化療藥物多西他賽、順鉑等可以顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；李秀萍等[15]研究發(fā)現(xiàn)TRAIL通過(guò)降低表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)水平抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲。除了影響增殖、侵襲和凋亡外，TRAIL還可以增強(qiáng)食管癌的化療療效，提高藥物敏感性，例如順鉑等化療藥物[16]。因此，TRAIL有成為食管癌重要治療手段的潛力，有必要進(jìn)一步開(kāi)展關(guān)于TRAIL在食管癌治療中的相關(guān)研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TRAIL過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用，有成為食管癌治療靶點(diǎn)的潛力。然而，TRAIL過(guò)表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞遷移、周期以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等的影響以及分子機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。這些研究對(duì)于提高食管癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要的意義。