牦牛乳源嗜熱鏈球菌直投式發(fā)酵劑的制備及應(yīng)用

劉剛，梁琪*，宋雪梅，張炎

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))，甘肅 蘭州，730070)

牦牛乳是一種特有的天然綠色產(chǎn)品，營養(yǎng)成分高于普通牛乳，是乳制品加工的最優(yōu)原料之一[1]。全世界牦牛存欄數(shù)為1 400多萬頭，其中中國大陸占90%以上[2]。對(duì)于牦牛乳乳制品，國內(nèi)乳品企業(yè)的發(fā)酵菌種均來自國外科漢森和丹尼斯克2個(gè)公司，我國密切關(guān)注國內(nèi)菌種及發(fā)酵劑的發(fā)展，因此，對(duì)牦牛乳特有乳酸菌及其發(fā)酵劑的研究至關(guān)重要。真空冷凍干燥后的菌株具備活菌數(shù)含量高、遺傳穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[3-4]，但冷凍干燥也會(huì)導(dǎo)致微生物活力降低甚至死亡[5-6]。菌株在真空冷凍干燥過程中，菌體細(xì)胞由于機(jī)械損傷、DNA損傷等受到不同程度傷害[7]，選擇適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑，則可使菌株保留自身的生物活性和理化特征[8]。因此，在工業(yè)化生產(chǎn)中，合適的保護(hù)劑不僅能有效地保護(hù)菌株的效能，而且能提高乳酸菌發(fā)酵劑和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量，從而使企業(yè)和農(nóng)戶增收增效。

本研究以甘肅藏區(qū)牦牛乳中篩選并誘變處理的嗜熱鏈球菌[9]為研究對(duì)象，研究凍干條件和保護(hù)劑對(duì)其影響，以期為乳品發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用，尤其是牦牛乳品工業(yè)的應(yīng)用提供直投式發(fā)酵劑資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilesQ4F8，由甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室分離純化，于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保藏；商業(yè)發(fā)酵劑(嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌)，丹尼斯克有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

GM17培養(yǎng)基[10]：多聚蛋白胨5 g，植物蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，牛肉膏5 g，乳糖5 g，抗壞血酸鈉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO45 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.9±0.2，于121 ℃高溫滅菌20 min。

脫脂乳培養(yǎng)基：120 g/L的脫脂乳，于115 ℃下滅菌15 min。

1.1.3 試劑

脫脂乳(食品級(jí))：完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司；谷氨酸鈉、甘油、海藻糖、0.01 mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)液、雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)液、三氯乙酸、NaHSO3、淀粉、鄰苯二胺、NaCl、酚酞(分析純)：上海國藥集團(tuán)。

緩沖劑A(pH 6.86)：Na2HPO4(11.876 g/L)溶液，KH2PO4(9.078 g/L)溶液，配制而成。

緩沖劑B(pH 6.0)：NaOH(0.1 mol/L)溶液，KH2PO4(0.2 mo1/L)溶液，配制而成。

緩沖劑C(pH 6.4)：KH2PO4(0.2 mo1/L)溶液，NaOH(0.2 mo1/L)溶液，配制而成。

1.2 儀器與設(shè)備

723型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司； SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司； PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；紫外燈，南京華強(qiáng)電子有限公司；YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；LVDV-1數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，上海方瑞儀器有限公司；TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司； FR224CN型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；BCD-539WF海爾家用電冰箱，青島海爾股份有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)，寧波生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株Q4F8生長特性的研究

將活化后的嗜熱鏈球菌Q4F8按3%的體積分?jǐn)?shù)接種于GM17培養(yǎng)基，42 ℃恒溫培養(yǎng)，每2 h取樣，通過平板稀釋涂布法，測定菌液的活菌數(shù)，連續(xù)測定至24 h，以時(shí)間和活菌數(shù)作圖并繪制嗜熱鏈球菌的生長曲線。

1.3.2 緩沖劑對(duì)菌株生長特性影響

通過菌株Q4F8的生長曲線，得出菌株開始“自溶”的時(shí)間點(diǎn)T[11]。將菌株活化后，分別以1.5%體積分?jǐn)?shù)的接種量接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，于42 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h測定培養(yǎng)液的OD600值。從時(shí)間點(diǎn)T前2 h時(shí)為T1點(diǎn)，開始按照1.5%的量添加緩沖劑，此后每隔2 h添加1次，每次添加量為1.5%，直至菌落的OD值沒有明顯變化為止。

1.3.3 保護(hù)劑的配制

由于NaCl可影響糖代謝關(guān)鍵酶[12]，從而能調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞的糖代謝活動(dòng)。因此，選擇85 g/L的NaCl配制各個(gè)質(zhì)量濃度梯度的凍干保護(hù)劑，滅菌后于4 ℃保藏，備用。其中，海藻糖和谷氨酸采用0.22 μm的微孔濾膜(有機(jī)相)過濾除菌，脫脂乳和甘油采用高溫高壓滅菌(115 ℃，15 min)。

1.3.4 發(fā)酵劑的制備

將菌株加入1.5%緩沖劑并發(fā)酵至對(duì)數(shù)后期，取發(fā)酵液離心(4 ℃)，離心后菌泥中加入適量生理鹽水溶解，將離心后的菌體和保護(hù)劑按1∶3(V/V)于旋渦振蕩器混勻后，冰箱中預(yù)處理8 h，立即放入滅菌的真空冷凍干燥設(shè)備中處理。

凍干前首先用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精噴灑冷凍干燥機(jī)進(jìn)行滅菌處理，迅速將預(yù)凍樣品放入，進(jìn)行抽真空冷凍24 h。真空冷凍干燥結(jié)束，對(duì)樣品進(jìn)行真空封口包裝，4 ℃低溫保藏。加入與凍干前樣品等體積生理鹽水與菌粉復(fù)容，采用稀釋平板法測定菌落數(shù)，并計(jì)算存活率，如式(1)所示，試驗(yàn)平行3次。

(1)

1.3.5 離心條件對(duì)菌泥得率的影響

取最優(yōu)條件下培養(yǎng)的發(fā)酵液，裝入無菌離心管中，分別在4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 r/min條件下，離心10、15、20 min。用等量的無菌生理鹽水稀釋沉淀，測定菌落數(shù)，計(jì)算菌泥得率(如式2所示)。

(2)

式中：m為加入發(fā)酵液后離心管質(zhì)量,g；m1為離心管空質(zhì)量,g；m2為離心后棄去上清液離心管質(zhì)量,g。

1.3.6 預(yù)凍溫度對(duì)菌株存活率影響

將制備好的菌懸液在42 ℃下放置30 min，分別在4、-20和-80 ℃下預(yù)凍8 h，以100 g/L脫脂乳為保護(hù)劑進(jìn)行真空冷凍干燥，待菌液完全凍結(jié)后迅速轉(zhuǎn)移至滅菌冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，測定菌株存活率。計(jì)算參照公式(1)。

1.3.7 凍干保護(hù)劑的篩選

1.3.7.1 單一凍干保護(hù)劑對(duì)存活率的影響

選擇不同濃度的脫脂乳、甘油、海藻糖、谷氨酸鈉為保護(hù)劑，如表1所示，并測定菌株存活率。

表1 凍干保護(hù)劑試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and the levels of cryoprotectant

1.3.7.2 復(fù)合凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn)

按照L9(34)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案制備凍干菌粉的保護(hù)劑，計(jì)算凍干后菌體的存活率為篩選指標(biāo)，選取保護(hù)劑最優(yōu)配方。保護(hù)劑添加水平見表2。

表2 復(fù)合凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and the levels of compound cryoprotectant

1.3.8 貯藏期發(fā)酵劑穩(wěn)定性檢測

將制備好的凍干保護(hù)劑菌粉通過非真空和真空包裝，貯藏于-18、4和25 ℃，測定0、15、30、45、60、75和90 d后的活菌數(shù)。發(fā)酵劑中加入與凍干前等體積滅菌生理鹽水(85 g/L)復(fù)溶，搖勻后稀釋涂布計(jì)數(shù)，以活菌數(shù)為指標(biāo)，研究貯藏期間發(fā)酵劑的穩(wěn)定性。

1.3.9 凍干菌粉發(fā)酵性能驗(yàn)證

常溫條件下，商業(yè)發(fā)酵劑和凍干菌粉用85 g/L滅菌生理鹽水復(fù)溶凍干菌粉30 min，復(fù)溶菌液按3%接種于半脫脂牦牛乳中(脂肪含量≥3.1%)，在42 ℃發(fā)酵直至凝乳。記錄凝乳時(shí)間,測定滴定酸度、活菌數(shù)、黏度和感官評(píng)價(jià)。

1.3.9.1 滴定酸度測定

參照GB 5009.239—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酚酞指示法測定滴定酸度。

1.3.9.2 活菌數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)法測定。

1.3.9.3 黏度測定

采用LVDV-1數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，參數(shù)設(shè)置：選擇3號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為6 r/min。單位為Pa·s。

1.3.9.4 感官評(píng)價(jià)

發(fā)酵乳凝乳后于4 ℃冰箱貯藏24 h，由10人組成評(píng)價(jià)小組，對(duì)酸乳的色澤、風(fēng)味和組織狀態(tài)進(jìn)行描述及評(píng)分[13]。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Standard for sensory characteristics of yogurt

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖處理，SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏多重比較方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Q4F8的生長特性研究

對(duì)初始嗜熱鏈球菌菌株活菌數(shù)的生長指標(biāo)進(jìn)行測定。由圖1可以看出，0～4 h為該菌株的調(diào)整期，發(fā)酵液的各項(xiàng)指標(biāo)基本保持一致。4～12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌體在適宜的生長環(huán)境下，其菌落數(shù)出現(xiàn)急劇增加的趨勢(shì)。發(fā)酵12 h時(shí)菌株達(dá)到自溶點(diǎn)(0T)。微生物自溶是菌體在不利環(huán)境中生存的一種方式，發(fā)酵乳中乳酸菌自溶，既破壞發(fā)酵劑成分，又使得乳酸菌活菌數(shù)降低，自溶分解的細(xì)胞質(zhì)，將會(huì)改變發(fā)酵乳的感官性狀和生產(chǎn)周期[14-15]。

圖1 嗜熱鏈球菌Q4F8的生長曲線Fig.1 Growth curve of Streptococcus thermophilus Q4F8

2.2 緩沖劑對(duì)菌體生長特性的影響

由圖2可知，在菌株培養(yǎng)至自溶點(diǎn)時(shí)期添加不同緩沖劑，菌株活菌數(shù)都有不同程度的增殖，增殖情況由強(qiáng)到弱依次為：緩沖劑A>緩沖劑C>緩沖劑B。同一時(shí)期，不同緩沖劑對(duì)菌株的生長量全部呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，說明緩沖劑可緩解乳酸菌的自溶現(xiàn)象。在一定范圍內(nèi)，緩沖劑可調(diào)節(jié)菌體自身產(chǎn)酸造成的影響，不同的環(huán)境條件對(duì)乳酸菌自溶程度和產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味產(chǎn)生不同影響[16-17]。因此，選擇pH為6.86的緩沖劑較為適宜。

圖2 緩沖劑對(duì)菌體生長特性的影響Fig.2 Effect of growth characteristic on cell注：a,b,c,d等不同字母表示試驗(yàn)結(jié)果差異性顯著(P<0.05)。

2.3 離心條件的確定

由表4可知，隨著離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的增加，活菌數(shù)量和細(xì)胞存活率都呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，而菌泥得率呈現(xiàn)增長趨勢(shì)。離心力越大對(duì)菌體的損傷越大，離心時(shí)間對(duì)菌體造成的損傷小于離心力造成的損傷，根據(jù)菌泥得率的趨勢(shì)變化，在6 000 r/min離心10 min之后的菌泥得率變化不明顯(P>0.05)且細(xì)胞存活率較高達(dá)到89.23%，故采用6 000 r/min離心10 min后收集菌體，得到菌體的最大收集量。研究表明，不同離心條件和離心時(shí)間影響菌體的代謝產(chǎn)物含量、細(xì)胞的抗凍性和貯藏性能，而離心溫度對(duì)以上菌體的性能影響不顯著性[18-19]。

表4 離心條件的篩選試驗(yàn)結(jié)果×10-10Table 4 The screen experimental result of conditions for centrifuging

注：A,B,C,D等不同字母表示試驗(yàn)結(jié)果差異性及顯著(P<0.01)。

2.4 預(yù)凍溫度對(duì)菌株的影響

由圖3可知，凍干菌株的存活率隨著預(yù)凍溫度的增加不斷下降，但-80和-20 ℃變化不顯著(P>0.05)。考慮到資源和成本的節(jié)約，選擇-20 ℃作為該菌株的預(yù)凍溫度。說明-20 ℃預(yù)凍處理，可明顯提高凍干菌株的存活率，這與BRAVO[20]的報(bào)道相一致。乳酸菌直接冷凍會(huì)對(duì)其造成細(xì)胞膜的破壞和嚴(yán)重機(jī)械損傷，預(yù)凍溫度不僅影響菌體細(xì)胞內(nèi)冰晶的大小，而且對(duì)菌體的干燥時(shí)間也有很大影響。因此，研究預(yù)凍處理是非常有必要的。低溫條件下，乳酸菌冷凍的處理直接影響菌株的活力，其活力受預(yù)凍溫度、時(shí)間和速率的影響較大[21-22]。

圖3 預(yù)凍溫度對(duì)菌株存活率的影響Fig.3 Effect of pre-freezing temperature on survival rate注：a,b,c,d等不同字母表示試驗(yàn)結(jié)果差異性顯著(P<0.05)。

2.5 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

2.5.1 單一凍干保護(hù)劑的優(yōu)化篩選

由圖4可知，從菌體細(xì)胞存活率最大情況分析得知，當(dāng)單一保護(hù)劑質(zhì)量濃度分別為150 g/L脫脂乳、10 g/L的谷氨酸鈉、60 g/L的甘油和80 g/L的海藻糖時(shí)，其菌體細(xì)胞存活率最大。

脫脂乳是蛋白類保護(hù)劑，與菌體易形成多孔結(jié)構(gòu)，在菌體表面形成保護(hù)層，減少菌體細(xì)胞表面積的暴露和細(xì)胞壁的損害[23-24]；谷氨酸鈉是抗氧化劑類保護(hù)劑，在冷凍干燥期間，乳酸菌會(huì)產(chǎn)生過氧化物自由基而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，一定量的抗氧化劑可減輕細(xì)胞受到的損傷[25]，且谷氨酸鈉與水分子結(jié)合，水分子在凍干后可維持細(xì)胞生命活動(dòng)，提高菌體存活率[26]；甘油是滲透性保護(hù)劑，可自由進(jìn)入細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，冷凍時(shí)與菌體成玻璃態(tài)，從而抑制細(xì)胞冰晶的形成，保護(hù)具體免受傷害[26]；海藻糖是糖類保護(hù)劑，其二糖形式效果最佳[27]，如海藻糖的羥基和蛋白質(zhì)形成氫鍵，穩(wěn)定了菌體蛋白結(jié)構(gòu)，提高乳酸菌的存活率[28]。

雖然各保護(hù)劑對(duì)乳酸菌可達(dá)到一定的保護(hù)作用，但要達(dá)到最佳保護(hù)效果必須通過各保護(hù)劑之間的協(xié)同作用，共同保護(hù)菌體細(xì)胞以提高乳酸菌菌體的存活率。

圖4 單一凍干保護(hù)劑對(duì)菌株存活率的影響Fig.4 Effect of single protectant on survival rate注：不同字母表示差異性顯著(P<0.05)。

2.5.2 復(fù)合凍干保護(hù)劑的正交篩選

按單一保護(hù)劑選取的最佳添加比例進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 復(fù)合凍干保護(hù)劑L9(34)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of orthogonal experimental design L9(34) on protectants

注：不同字母表示差異性顯著(P<0.05)。

表5結(jié)果表明，相較單一保護(hù)劑對(duì)嗜熱鏈球菌Q4F8菌株的存活率，復(fù)合保護(hù)劑具備更好的保護(hù)效果。符合保護(hù)劑能夠相互達(dá)到互補(bǔ)，協(xié)同效果增強(qiáng)，從表5可以看出，正交試驗(yàn)得出的保護(hù)劑優(yōu)化方案為：150 g/L脫脂乳、10 g/L的谷氨酸鈉、60 g/L的甘油和80 g/L的海藻糖，雖然單一保護(hù)劑的最佳效果和正交試驗(yàn)一致，但通過正交試驗(yàn)得出的菌株Q4F8的存活率為90.08%，正好驗(yàn)證復(fù)合凍干保護(hù)劑是由單一保護(hù)劑相互間協(xié)同保護(hù)而作用的效果。正交試驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果與未添加的保護(hù)劑的存活率相比菌株呈顯著性增加(無保護(hù)劑的凍干菌粉菌株存活率為21.16%)。

2.6 發(fā)酵劑貯藏穩(wěn)定性研究

由圖5可知，在真空包裝和非真空條件下，發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性存在明顯差異(P<0.05)。經(jīng)90 d的儲(chǔ)藏，菌株在-18 ℃的真空條件下，其活菌數(shù)下降不明顯(P>0.05)。

圖5 發(fā)酵劑的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.5 Storage stabilitys of starter

冷凍干燥期間，微生物表面水分活度降低，有益于菌體細(xì)胞的熱穩(wěn)定性，提高菌株的存活率[29]。儲(chǔ)藏凍干菌粉時(shí)，儲(chǔ)藏條件下的氣體組分，特別是氧含量對(duì)儲(chǔ)存效果有很大影響。當(dāng)儲(chǔ)藏溫度高于玻璃化的轉(zhuǎn)化溫度時(shí)，分子間的運(yùn)動(dòng)空間增大，發(fā)生一系列反應(yīng)，從而對(duì)菌體活力造成影響[30]。TCIXCIRA[31]研究發(fā)現(xiàn)，在氧氣存在的情況下，凍干菌細(xì)胞膜中的脂質(zhì)會(huì)和氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)，嚴(yán)重影響菌粉儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性，所以對(duì)凍干菌粉進(jìn)行儲(chǔ)藏時(shí)，通常選擇真空包裝來避免氧化反應(yīng)的發(fā)生。

2.7 發(fā)酵劑發(fā)酵特性研究

嗜熱鏈球菌凍干發(fā)酵劑和商業(yè)發(fā)酵劑對(duì)比結(jié)果如表6所示，由于凍干發(fā)酵劑為單菌株的直投式發(fā)酵劑，而商業(yè)發(fā)酵劑則是球菌與桿菌兩者的共生作用，較單一菌株加快了發(fā)酵進(jìn)程，縮短了凝乳時(shí)間。由表6可知，雖然凝乳時(shí)間比商業(yè)發(fā)酵劑較長，但滴定酸度為89.790T和活菌數(shù)含量4.63 lgCFU/mL與商業(yè)發(fā)酵劑活菌數(shù)和滴定酸度之間不顯著(P>0.01)，馮家適用于商業(yè)化可能是由于實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)酵菌株活力及富集時(shí)的含量高，導(dǎo)致凍干發(fā)酵劑的滴定酸度和活菌數(shù)的增大。凍干發(fā)酵劑酸乳酸甜適中、黏度厚實(shí)、色澤呈乳白色組織細(xì)膩均勻、無乳清的析出，感官評(píng)價(jià)91.60分，其黏度值和感官評(píng)價(jià)均與商業(yè)發(fā)酵劑呈極顯著性差異(P<0.01)。風(fēng)味物質(zhì)一般在4 h左右產(chǎn)生，而酸乳的風(fēng)味是由多種物質(zhì)共同作用產(chǎn)生的結(jié)果[32]，因此，凍干發(fā)酵劑長時(shí)發(fā)酵的酸奶其風(fēng)味更加濃厚。

表6 凍干發(fā)酵劑檢驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of fermentation performance on freeze-dried starter culture

注：不同大寫字母表示每列數(shù)據(jù)間差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

牦牛乳不僅在蛋白質(zhì)、脂肪和乳糖等營養(yǎng)價(jià)值均高于其他牛乳，而且是乳制品加工的最優(yōu)原料之一[33]，而牦牛乳中含有高產(chǎn)胞外多糖、產(chǎn)細(xì)菌素、耐酸和耐膽鹽等性能良好的乳酸菌菌群，但針對(duì)牦牛乳的直投式發(fā)酵劑卻無人問津，本研究將甘肅藏區(qū)牦牛乳酸奶中獲得的一株嗜熱鏈球菌[34]經(jīng)誘變選育得到的高產(chǎn)EPS菌株進(jìn)行功能性直投式發(fā)酵劑研究，通過凍干條件和保護(hù)劑的優(yōu)良篩選，旨在開發(fā)用于牦牛乳酸奶的發(fā)酵劑。

通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳牦牛乳直投式發(fā)酵劑制備條件為：選擇pH為6.86的磷酸緩沖劑做緩沖劑培養(yǎng)、6 000 r/min離心10 min條件收集菌體、-20 ℃預(yù)凍處理和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為150 g/L脫脂乳、10 g/L的谷氨酸鈉、60 g/L的甘油和80 g/L的海藻糖作復(fù)合保護(hù)劑組合條件。最終表明嗜熱鏈球菌單菌株發(fā)酵劑在牦牛乳發(fā)酵工業(yè)上具備良好的發(fā)酵特性，同時(shí)為功能性乳酸菌更好地服務(wù)于發(fā)酵工業(yè)和乳酸菌發(fā)酵劑的工業(yè)化制備與應(yīng)用提供理論參考。