短乳桿菌和植物乳桿菌產(chǎn)γ-氨基丁酸及其關(guān)鍵基因的研究

韓嘯，于雷雷，翟齊嘯，崔樹茂，趙建新，張灝，田豐偉，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]。研究表明，GABA具有降血壓[2]、抗焦慮[3]、保護(hù)腎臟[4]、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌[5]、增強(qiáng)免疫力[6]等生理功能。作為一種新型功能因子，GABA現(xiàn)已逐步應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖等行業(yè)中。

GABA廣泛分布于動(dòng)物、植物和細(xì)菌中，而乳桿菌被認(rèn)為是細(xì)菌中GABA的重要生產(chǎn)者。已報(bào)道常見(jiàn)的具有產(chǎn)GABA能力的乳桿菌包括短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)[7-9]、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)[10-12]、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)[13-14]、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)[15]等。乳桿菌中GABA是由L-谷氨酸或其衍生物在谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)作用下經(jīng)過(guò)不可逆脫羧而成的，和菌體自身耐酸機(jī)制有關(guān)。當(dāng)受到環(huán)境的酸脅迫時(shí)，乳桿菌細(xì)胞質(zhì)中的GAD消耗細(xì)胞內(nèi)的H+，催化L-谷氨酸脫羧生成GABA，而位于細(xì)胞膜上的Glu/GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則將細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)產(chǎn)物GABA交換到細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的L-谷氨酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。在此過(guò)程中，乳桿菌細(xì)胞內(nèi)的pH維持了穩(wěn)態(tài)，從而使菌體在酸性環(huán)境中得以存活[16]。

人們觀察到，不同種屬乳桿菌產(chǎn)GABA的能力不同，同種屬間的產(chǎn)GABA能力也有差異[15]。影響GABA產(chǎn)量最常見(jiàn)和最重要的因素是pH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基添加劑等。所以，現(xiàn)有研究大都集中在尋找最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以獲得更高的GABA產(chǎn)量[17]，但是對(duì)于乳桿菌產(chǎn)GABA的情況以及相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律缺少系統(tǒng)性研究。本研究選取了8個(gè)種屬68株的乳桿菌，在NCBI-GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)這幾個(gè)種屬進(jìn)行基因組學(xué)調(diào)查，利用高效液相色譜法(high efficiency liquid chromatography，HPLC)比較了不同種屬間產(chǎn)GABA能力的差異，并研究了上述乳桿菌GAD相關(guān)基因在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平的差異，以期為后續(xù)產(chǎn)GABA菌株的篩選，GAD基因的表達(dá)調(diào)控，GABA發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

由發(fā)酵食品與健康人群新鮮糞便篩選得到8個(gè)種屬68株乳桿菌(表2)，均來(lái)自于江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基，用于乳桿菌的活化；MMRS發(fā)酵培養(yǎng)基，用于產(chǎn)GABA乳桿菌的篩選。

MRS培養(yǎng)基成分(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏 10，酵母粉 5，葡萄糖 20，無(wú)水乙酸鈉 2，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.25，檸檬酸氫二銨 2，K2HPO4·3H2O 2.6，Tween 80 1，pH值6.2～6.4。

MMRS培養(yǎng)基成分(g/L)：在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%的L-谷氨酸鈉作為GABA合成的前體物質(zhì)。

1.3 材料與試劑

GABA標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-谷氨酸鈉(L-MSG)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；TRIzol試劑，Qiagen公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；2×TaqMasterMix(Dye)，康為世紀(jì)生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(Takara中國(guó))；其他試劑為市售分析純。引物合成，上海生工生物工程有限公司。

1.4 儀器與設(shè)備

高效液相色譜，美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)ZHJH-C1115B，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；電子天平，精密pH計(jì)FE-20，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋MLS-3750，日本Sanyo公司； T100PCR儀，核酸電泳儀，凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司；CFXConnect Real-time System，美國(guó)Bio-Rad公司；冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，德國(guó)Millipore公司。

1.5 方法

1.5.1 產(chǎn)GABA乳桿菌的篩選

1.5.1.1 菌株培養(yǎng)條件

將實(shí)驗(yàn)室保藏的乳桿菌菌株進(jìn)行活化，用接種環(huán)蘸取保菌管中少量菌液在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，平板置于37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接入5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)18 h。以2%的接種量接入到10 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h作為后續(xù)培養(yǎng)的種子液。取2%的種子液接種到添加了1.5%MSG的MMRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.5.1.2 樣品預(yù)處理

取不同發(fā)酵時(shí)間(6、12、24、48 h)的樣品1 mL，經(jīng)8 000 r/min離心5 min，將上清液稀釋一定倍數(shù)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即可用于衍生反應(yīng)。

1.5.1.3 發(fā)酵液中GABA含量的測(cè)定

本研究使用HPLC測(cè)定發(fā)酵上清液中的GABA的含量。分析條件按照國(guó)標(biāo)QBT 4587—2013修改而成。色譜條件為：色譜柱Hypersil GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為20 mmol/L醋酸鈉水溶液，流動(dòng)相B為V(40 mmol/L醋酸鈉水溶液)∶V(乙腈)=1∶1；流速0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm。洗脫梯度為0～6 min，B由30%升至50%；6～11 min，B由50%升至60%；11～12 min，B由60%升至100%并保持3 min；15～16 min，B由100%降至30%；16～20 min，30% B保持4 min。

樣品衍生：

(1)0.4 mol/L硼酸緩沖液的制備：準(zhǔn)確稱取2.47 g硼酸，加水約80 mL，用NaOH將pH調(diào)至10.2，用水定容至100 mL。

(2)衍生試劑的制備：稱取0.1 g鄰苯二甲醛(OPA)，用1 mL乙腈溶解，然后加入130 μL巰基乙醇，用水定容至100 mL。

(3)樣品柱前衍生：吸取衍生試劑10 μL，預(yù)處理后樣品10 μL，混合均勻后在室溫下反應(yīng)90 s后進(jìn)樣。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置：精確配制質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別衍生進(jìn)樣后，以GABA的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5.2 GAD相關(guān)基因序列擴(kuò)增

菌體總DNA的提取采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書操作。使用軟件Primer 5.0分別對(duì)GAD相關(guān)基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。本文所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

PCR反應(yīng)體系： 2×TaqMasterMix 12.5 μL，DNA模板 1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性 30 s, 57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán); 72 ℃退火5 min。

1.5.3 GAD相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄分析

1.5.3.1 乳桿菌RNA提取

菌株的培養(yǎng)同1.5.1.1分別取6，12，24和48 h的發(fā)酵液，于8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取適量菌泥于滅酶后的研缽中，倒入適量液氮進(jìn)行研磨，重復(fù)研磨3次，將粉末收集于無(wú)酶1.5 mL離心管中，加入1 mL TRIzol，混勻，置于4 ℃冰盒，以下操作均在4 ℃下完成。每個(gè)離心管加入1/5體積的三氯甲烷(提前4 ℃預(yù)冷)，即200 μL，手搖振蕩后，靜置5 min，分層，12 000×g4 ℃離心15 min，用槍頭吸取最上層300 μL至新的無(wú)酶1.5 mL離心管中。加入300 μL等體積的異丙醇(提前4 ℃預(yù)冷)，靜置10 min，于12 000×g4 ℃離心15 min，棄上清，可適當(dāng)留底。加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配制，提前4 ℃預(yù)冷)于12 000×g4 ℃離心7 min，棄上清，可適當(dāng)留底，重復(fù)1次，自然放置晾干，加入20 μL DEPC水，輕彈，混勻。取1 μL，測(cè)RNA濃度。

1.5.3.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄

使用PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR所用引物見(jiàn)表1，其中16S rRNA基因作為內(nèi)參基因。

RT-PCR體系為20 μL體系：1 μL模板；2 μL mix；17 μL無(wú)酶ddH2O。反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、10 min。qPCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 不同乳桿菌產(chǎn)GABA能力研究

本文利用HPLC研究了由發(fā)酵食品與健康人群新鮮糞便篩選得到的8個(gè)種屬68株乳桿菌，具有產(chǎn)GABA能力。從表2和圖1可以看出，產(chǎn)GABA的菌株主要集中在L.brevis、L.plantarum這2個(gè)種屬上，其中L.brevis發(fā)酵上清液的GABA含量可達(dá)5 000 mg/L左右，L.plantarum發(fā)酵上清液的GABA含量可達(dá)400 mg/L左右。而其余種屬的菌株的發(fā)酵上清液并沒(méi)有檢測(cè)到GABA的存在。結(jié)果表明乳桿菌產(chǎn)GABA的能力具有種屬特異性。同時(shí)，同一種屬中有的菌株產(chǎn)GABA的能力高，而有的菌卻基本不利用MSG產(chǎn)GABA。以L.brevis為例，L.brevisHY2-1、DL1-11、RS6-12均能產(chǎn)生較高水平的GABA，其中L.brevisDL1-11產(chǎn)量最高，為5 072 mg/L。但與此同時(shí)，L.brevisWX7-1、WX7-3、WX17-3的GABA的含量卻很低。因此，我們認(rèn)為同一種屬的不同菌株產(chǎn)GABA能力也是不同的，具有種內(nèi)特異性(表2)。

表2 不同乳桿菌產(chǎn)GABA能力Table 2 Production of GABA by different lactobacilli

圖1 不同植物乳桿菌和短乳桿菌產(chǎn)GABA能力圖Fig.1 Different L. plantarum and L. brevis produce GABA ability

2.2 乳桿菌GAD相關(guān)基因的基因組學(xué)調(diào)查

目前，已經(jīng)報(bào)道了微生物中GABA產(chǎn)生主要是通過(guò)腐胺的降解(Puu和ADC途徑)或谷氨酸的脫羧(GAD途徑)這2種途徑。然而，由于缺乏Puu和ADC途徑，由腐胺降解產(chǎn)生的GABA在乳桿菌中并不常見(jiàn)[19]。gad操縱子主要由編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(gadR)、谷氨酸脫羧酶(gadA或gadB)和Glu/GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(gadC)的基因組成。目前，已有超過(guò)1 000種乳酸菌已經(jīng)測(cè)序并保藏在NCBI-GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。因此，對(duì)本研究所用的8種乳桿菌進(jìn)行了基因組調(diào)查，以檢測(cè)是否存在gad操縱子和編碼谷氨酸脫羧酶的基因，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，許多菌株攜帶gadA或gadB，但是gadR、gadC僅存在于有限種屬的基因組中，表明它們具有種屬特異性。其中，L.brevis與其他種類的乳桿菌有明顯的不同：(1)具有完整的gad操縱子，(2)其基因組中有2個(gè)編碼谷氨酸脫羧酶的基因(gadA和gadB)。雖然大多數(shù)L.plantarum擁有g(shù)adB基因，但在我們調(diào)查的菌株中都沒(méi)有g(shù)adC。YUNES等[19]在L.plantarum90sk的基因組發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)，其與L.brevis15f的gadC的氨基酸序列具有25%的同源性。該蛋白質(zhì)在Inter-ProScan中注釋為氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，他們認(rèn)為這種蛋白質(zhì)在L.plantarum90sk中可能發(fā)揮類似于Glu/GABA逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。盡管本研究中所用的L.reuteri均不能產(chǎn)GABA，但基因組學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示很多L.reuteri也含有g(shù)adB和gadC。有趣的是，SU等[20]通過(guò)基因組分析發(fā)現(xiàn)L.reuteri100-23 谷氨酸代謝的基因簇中含有2個(gè)Glu/GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(gadC1和gadC2)，還含有編碼的谷氨酰胺酶亞型3的基因gls3。因?yàn)楣劝滨０房稍诠劝滨０访傅淖饔孟律晒劝彼?，所以L.reuteri100-23中這種特殊的谷氨酰胺脫酰胺和谷氨酸脫羧耦聯(lián)形式更有助于菌體耐受酸脅迫，也具有高產(chǎn)GABA的潛力。此外，L.fermentum、L.reuteri在基因水平上顯示其也有產(chǎn)GABA的潛力。對(duì)于L.paracasei、L.helveticus等種屬來(lái)說(shuō)，大多數(shù)菌株不含有g(shù)adB基因，這可能是本研究中上述種屬的菌株不產(chǎn)GABA的根本原因。

表3 不同乳桿菌GAD基因分布情況Table 3 Distribution of gad operon and genes encoding glutamate decarboxylases in the sequenced

注：基因組調(diào)查日期截止于2019年1月1日。

我們?cè)谏鲜鰮碛術(shù)adA或gadB基因的種屬中各選取1株，作出其GAD系統(tǒng)相關(guān)基因分布圖如圖2-A所示，L.brevisgad操縱子同源性分析如圖2-B所示。

圖2 乳桿菌GAD基因相對(duì)位置和短乳桿菌gad操縱子同源性分析圖(A)和乳桿菌GAD基因相對(duì)位置(B)短乳桿菌gad操縱子氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Common distribution and arrangement of gad operon in Lactobacillus strains and Homology analysis of L.brevis GAD operon (A) Distribution of gad operon in Lactobacillus strains and (B)Phylogeny of amino acids sequences of four components in gad operon of L.brevis

可以看出，L.brevis基因組中g(shù)adR和gadC彼此接近可確保其及時(shí)共同調(diào)節(jié)gadB的轉(zhuǎn)錄和翻譯以用于GABA生產(chǎn)，gadA基因位置與gadB位置較遠(yuǎn)且同源性不高，說(shuō)明可能gadA與gadB的基因調(diào)控方式不同。但是gadA和gadB的共同存在可能是L.brevis高GABA合成能力的原因。

2.3 乳桿菌GAD相關(guān)基因序列擴(kuò)增

為了研究本文所用乳桿菌是否擁有GAD相關(guān)基因，我們根據(jù)文獻(xiàn)中或GenBank上不同種屬已測(cè)序菌株GAD相關(guān)基因的保守區(qū)域，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)種屬特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3。

凝膠電泳結(jié)果顯示，6株L.brevis均具有完整的GAD操縱子，在14株L.plantarum中也檢測(cè)到8株擁有g(shù)adB基因，HPLC結(jié)果也表明6株沒(méi)有g(shù)adB基因的菌株沒(méi)有 GABA產(chǎn)生。而10株L.fermentum中有7株基因組中有g(shù)adC、gadB，但其發(fā)酵上清液中卻沒(méi)有檢測(cè)到GABA。YUNES等[21]研究了21株L.fermentum產(chǎn)GABA能力和gadB的分布情況，發(fā)現(xiàn)其中只有9株含有g(shù)adB基因且所有L.fermentum均不能利用MSG產(chǎn)GABA。他認(rèn)為這可能是由于L.fermentum中g(shù)adB、gadC基因的突變或并未表達(dá)引起的。除了上述3種乳桿菌，其余5個(gè)種屬的乳桿菌我們均未檢測(cè)到gadB的存在。盡管有研究成功克隆了L.paracasei、L.sakei的gadB基因[22-23]，但綜合本研究的GABA產(chǎn)量、基因組學(xué)調(diào)查和gadB的基因的擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，大多數(shù)L.paracasei、L.helveticus、L.casei和L.sakei是不含有g(shù)adB基因或者不具有產(chǎn)GABA能力的。

圖3 (A)乳桿菌GAD基因凝膠電泳結(jié)果、(B)短乳桿菌、(C)發(fā)酵乳桿菌和(D)植物乳桿菌Fig.3 PCR result of gad operon in (A)Lactobacillus strains，(B) L.brevis，(C) L. fermentum and(D) L. plantarum

2.4 L. brevis和L. plantarum GAD相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄分析

為了研究L.brevis和L.plantarum中GAD相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律以及轉(zhuǎn)錄水平和GABA產(chǎn)量之間的關(guān)系，我們將可以產(chǎn)生GABA的菌株分別發(fā)酵6、12、24、48h并利用qRT-PCR進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果如圖4。

圖4 短乳桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期GAD基因相對(duì)表達(dá)量變化(A)gadR、(B)gadC、(C)gadB和(D)gadAFig.4 Relative gene expression of of gad operon in L.brevis at different growth stages (A) gadR，(B)gadC，(C) gadB and (D) gadA

由于乳桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期前，培養(yǎng)液的pH值下降很快[18]。而GAD系統(tǒng)是細(xì)菌對(duì)抗酸性環(huán)境的耐酸系統(tǒng)之一，可以維持自身代謝和細(xì)胞活力[24]。所以，L.brevis的gadB和gadC的表達(dá)量變化與菌體的生長(zhǎng)時(shí)期相一致。隨著菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期，L.brevis為了耐受酸脅迫，gadB和gadC的表達(dá)量大幅增加。LI等[8]研究L.brevisNCL912在分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中g(shù)adC和gadB基因表達(dá)規(guī)律時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。從圖4可以看出，L.brevis的gadC和gadB的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，說(shuō)明可能有g(shù)adC和gadB的共轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物gadCB的存在。彭春龍等[18]設(shè)計(jì)了引物gad-P1和gad-P2，其中上游引物gad-P1位于gadC內(nèi)并臨近其3’端，下游引物gad-P2位于gadB內(nèi)并臨近其5’端，以菌體所提取mRNA的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，排除了基因組DNA污染的可能后，得到了約550 bp的目的片段，證明了gadCB的存在。在菌體不同生長(zhǎng)時(shí)期，gadA的表達(dá)量始終處于一個(gè)平穩(wěn)的狀態(tài)，說(shuō)明gadA可能與L.brevis耐酸系統(tǒng)無(wú)關(guān)。和6 h相比，6株L.brevis的gadR和gadA的變化量都很低，而gadC和gadB在12和24 h表達(dá)量迅速增加。短乳桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)酵液中GABA積累量變化如圖5所示，可以看出在gadC和gadB高表達(dá)的期間，發(fā)酵液中GABA迅速積累，而在24～48 h，積累速度有所減緩，發(fā)酵液中GABA的積累速度與gadC和gadB表達(dá)量變化呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，說(shuō)明gadC和gadB為L(zhǎng).brevis產(chǎn)GABA的關(guān)鍵基因。

圖5 短乳桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)酵液中GABA積累量變化Fig.5 Changes of GABA accumulation in fermentation broth of L. brevis at different growth stages

本文以L.brevisWX7-1為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)GABA產(chǎn)量較高的3株L.brevis的gadC和gadB的表達(dá)量顯著地超過(guò)了低產(chǎn)的菌株(圖6)，說(shuō)明L.brevisWX7-1、WX7-3、WX17-3這3株菌雖然擁有g(shù)adC和gadB基因，但其幾乎不表達(dá)或表達(dá)量少，直接導(dǎo)致了低水平的GABA產(chǎn)量。值得注意的是，最高基因表達(dá)量的L.brevisRS6-12的GABA產(chǎn)量卻沒(méi)有L.brevisDL1-11的高，這可能是由于GAD酶活不同導(dǎo)致的，需要進(jìn)一步研究。

圖6 不同短乳桿菌GAD基因相對(duì)表達(dá)量比較(A)gadC和(B)gadBFig.6 Relative expression of GAD gene in different L. brevis strains (A) gadC and (B) gadB

L.plantarum菌體不同生長(zhǎng)時(shí)期gadB相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果和L.brevis類似，菌體由延滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，gadB表達(dá)量不斷增高，在穩(wěn)定期達(dá)到了高峰，進(jìn)入穩(wěn)定期后期，表達(dá)量開始下降(圖7-A)。但以L.plantarumDL3-1為對(duì)照，gadB表達(dá)量高的菌株，GABA產(chǎn)量卻不一定高，例如L.plantarumHY8-2的gadB表達(dá)量在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量都比較高，但是GABA的最終積累量卻處于一個(gè)較低水平，說(shuō)明本研究中的L.plantarumGABA產(chǎn)量和gadB的表達(dá)量之間的關(guān)聯(lián)性沒(méi)有那么密切，可能是因?yàn)槌嘶虮磉_(dá)量，L.plantarum的GABA產(chǎn)量還和其他一些因素有關(guān)，例如酶活性、PLP濃度和pH等[25]。

圖7 植物乳桿菌gadB相對(duì)表達(dá)量(A)菌體不同生長(zhǎng)時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化和(B)不同植物乳桿菌GAD基因相對(duì)表達(dá)量比較Fig.7 Relative expression of gadB gene in L. plantarum (A) relative expression in different growth stages of L. plantarum and (B) comparison of relative expression of GAD gene in different L. plantarum strains

3 結(jié)論

根據(jù)本研究的GABA產(chǎn)量、基因組學(xué)調(diào)查和gadB的基因的擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，可得到以下結(jié)論：(1)L.brevis、L.plantarum可作為產(chǎn)GABA菌株的主要篩選對(duì)象。(2)L.fermentum和L.reuteri的部分菌株在基因水平也有產(chǎn)GABA的潛力。(3)大多數(shù)L.paracasei、L.helveticus、L.casei和L.sakei不含有g(shù)adB基因或者不具有產(chǎn)GABA能力。L.brevis和L.plantarumGAD相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明：(1)L.brevis的gadB和gadC的表達(dá)量變化與菌體的生長(zhǎng)時(shí)期相一致，在對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定前期達(dá)到高峰，且本研究的L.brevis高產(chǎn)GABA可能與gadC和gadB的高表達(dá)有關(guān)。(2)L.plantarum的gadB的表達(dá)量也在對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定前期達(dá)到高峰，但是GABA的產(chǎn)量和gadB的表達(dá)量之間相關(guān)性不強(qiáng)，可能受其他因素影響，有待進(jìn)一步研究。