同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析牦牛酥油中特征揮發(fā)性物質(zhì)

扎西窮達(dá)，劉吉愛，曹葉偉，王軍

1(西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院，西藏 拉薩，850000) 2(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

酥油在藏族人民飲食結(jié)構(gòu)中扮演著重要的角色[1]。牦牛酥油是牦牛乳發(fā)酵后提煉得到的，具有獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)，深受藏族同胞的喜愛[2-3]。在青藏高原地區(qū)，每年7～9月盛產(chǎn)牦牛酥油，具有獨(dú)特的口感和香氣。牦牛酥油的營養(yǎng)價(jià)值高，又具有一定的特殊功能，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前有關(guān)牦牛酥油中功能脂肪酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究很多[4]。其中，研究發(fā)現(xiàn)西藏牦牛酥油中的游離脂肪酸含量明顯高于其他奶類脂肪，藏牦牛酥油中的亞麻酸比普通奶油高3倍[6]，亞油酸是普通奶油的2倍多[7-8]，二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA) 僅存于牦牛酥油中[5]。對(duì)牦牛酥油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究，主要集中在利用固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)富集后利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定性分析。薛璐等采用固相微萃取頂空氣相-質(zhì)譜法測(cè)定了內(nèi)蒙酥油中的風(fēng)味物質(zhì)，在內(nèi)蒙古酥油中共檢出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[9]。HU等[10]和魯玉俠等[11]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在牦牛酥油中鑒定出了28種不同的風(fēng)味物質(zhì)等。牦牛酥油風(fēng)味獨(dú)特，但仍然缺乏其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與普通奶油之間的差別分析，以及是否含有特征風(fēng)味成分的研究報(bào)道。牦牛酥油經(jīng)發(fā)酵而成，與其他奶油加工工藝不同[12]，具有獨(dú)特風(fēng)味。但僅從外觀形狀和色澤無法將其與其他奶油類樣品進(jìn)行區(qū)分，因此市場上存在著將其他奶油類產(chǎn)品與牦牛酥油混淆的情況。因此，需要研究牦牛酥油與其他奶油產(chǎn)品間揮發(fā)性物質(zhì)的差異，尋找它們之間的關(guān)鍵的差別物質(zhì)，為區(qū)分牦牛酥油與其他奶油制品提供依據(jù)。

同時(shí)蒸餾萃取法(simultaneous-distextraction, SDE)在食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究具有較好重復(fù)性，操作簡便、富集效果好、受基質(zhì)影響小[13-15]。本研究利用同時(shí)蒸餾萃取法對(duì)牦牛酥油中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取和富集，再利用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，對(duì)牦牛酥油和其他奶油類樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析比較，尋找牦牛酥油中存在的特征揮發(fā)性物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行定量分析。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和試劑

7890B-597氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析色譜儀，美國安捷倫公司；同時(shí)蒸餾萃取裝置，安徽東冠設(shè)備有限公司；恒溫電熱套，力辰科技；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；萬分之一天平(感量0.000 1g)，英國Adam公司。

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，北京百靈威科技有限公司；戊酸乙酯、TCI，化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

試劑：二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷(色譜純)，北京百靈威科技有限公司；無水Na2SO4(分析純)，北京康普匯維科技有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

2.1.1 定性分析樣品制備

稱取20 g樣品于圓底燒瓶中，加蒸餾水50 mL，并加入少許沸石，在萃取瓶中加入50 mL萃取溶劑乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷)，裝入同時(shí)蒸餾萃取裝置，設(shè)置恒溫電熱套溫度，使兩端萃取瓶溫度處于微沸狀態(tài)，蒸餾萃取一定時(shí)間后冷卻，然后將萃取液用無水Na2SO4干燥去水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL左右，再用萃取溶劑定容至2.0 mL,用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)行GC-MS分析。

2.1.2 定量分析樣品制備

準(zhǔn)確稱取20 g樣品(精確到0.1 mg)于圓底燒瓶，加蒸餾水50 mL，并加入少許沸石，在萃取瓶中加入50 mL二氯甲烷，裝入同時(shí)蒸餾萃取裝置，設(shè)置恒溫電熱套溫度，兩端萃取瓶溫度處于微沸狀態(tài)，蒸餾萃取4 h，冷卻后，然后將萃取液用無水Na2SO4干燥去水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL左右，加入20 μL 1 mg/mL戊酸乙酯(內(nèi)標(biāo))，用二氯甲烷定容到2.0 mL，用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后用GC-MS進(jìn)行定量分析。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品制備

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二氯甲烷稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取戊酸乙酯液，用二氯甲烷稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)工作液，用二氯甲烷稀釋至1.0 mL，制成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL的標(biāo)液，加入的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

2.2 儀器條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱：DB-wax柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；流速：1.5 mL/min；柱溫：40 ℃保持4 min，5 ℃/min上升到100 ℃保持2 min，3 ℃/min上升到150 ℃，10 ℃/min上升到230 ℃保持8 min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：分流模式(分流10∶1)。

2.2.2 質(zhì)譜條件

2.2.2.1 定性分析質(zhì)譜條件

接口溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：SCAN；電離方式：EI。

2.2.2.2 定量分析質(zhì)譜條件

接口溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：SIM；電離方式：EI；定量分析：SIM分析，條件見表2。

表2 SIM分析條件Table 2 The condition of SIM scan

2.3 分析方法

2.3.1 揮發(fā)性物質(zhì)定性分析

通過氣相-質(zhì)譜儀分析出總離子流圖，通過保留時(shí)間和NIST譜庫檢索，選取匹配度均大于800的進(jìn)行化合物鑒定，該結(jié)果為定性結(jié)果。

2.3.2 乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯定量分析

樣品經(jīng)過同時(shí)蒸餾萃取后以戊酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)這3種酯類進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 特征揮發(fā)性成分定性

3.1.1 萃取溶劑優(yōu)化

選取酥油1樣品以同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)萃取揮發(fā)性物質(zhì)，分別用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3種不同極性的溶劑[16-18]萃取，分析對(duì)比萃取液GC-MS總離子流圖，酥油1樣品不同萃取液的氣-質(zhì)聯(lián)用分析總離子流色譜圖見圖1。

圖1 采用不同萃取溶劑的SDE方法萃取得到的揮發(fā)性物質(zhì)氣質(zhì)聯(lián)用總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of volatile compounds by SDE with different extracting solvents

由圖1分析比較得出，3種萃取溶劑中，二氯甲烷溶劑的極性適中，同時(shí)蒸餾萃取過程中萃取到的樣品所含的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，色譜峰面積較大，故本方法選用二氯甲烷作為同時(shí)蒸餾萃取溶劑，采用SDE法對(duì)各種牦牛酥油和其他類奶油制品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

3.1.2 牦牛酥油和其他類奶油揮發(fā)性成分對(duì)比

6種牦牛酥油類樣品和8種奶油類樣品中揮發(fā)性物質(zhì)定性分析見表3。

表3 牦牛酥油和其他奶制品中揮發(fā)性物質(zhì)定性分析Table 3 The qualitative analysis of volatile compounds in yak butter and other similar dairy products

續(xù)表3

分類化合物名稱牦牛酥油其他類酥油1酥油2酥油3酥油4酥油5酥油6奶油黃油蛋糕奶油奶酪再制干酪稀奶油植物黃油加鹽黃油酯類丁位十二內(nèi)酯++----++-+++++丁位十四內(nèi)酯+-----++--+-++丁位癸內(nèi)酯++++++++-+++++油酸甲酯--+-----------棕櫚酸甲酯-----------+--亞油酸乙酯--+-----------月桂酸乙酯----+---------酮類2-戊酮++++-+-+------2-己酮--+-----------2-庚酮++++++++++++-+2-壬酮++++++-+++++-+8-壬烯-2-酮--+-----------2-十一酮++++++++++++++2-辛酮--+--+-----+--2-十三酮------+-+-----2-十五酮--------+-----2-十三烷酮++++++-+-+++++2-十五烷酮++++++++-+++++3-羥基-2-丁酮----++---++++-醇類2-戊醇-++--+--------2-庚醇---+++--------正丁醇--------------苯甲醇--+-----------糠醇--+---+--+++--2-壬基醇-----+--------烷類十二烷+---+++-------十四烷--+-+++-------十五烷+-+-+---------十七烷----+----+----十八烷----+--------+十九烷----+---------二十一烷----+---------二十四烷----+---------二十六烷----+---------二十七烷----+---------二十八烷----+------- --醛類壬醛---------+-- --糠醛+--++---+-----苯甲醛--------+-----其他類甲苯++++--++++----苯乙烯-+----+-------N,N-二甲基甲酰胺-+-+--+-+-++--N,N-二甲基乙酰胺-+-+---++-----1,3-二叔丁基苯-----+--------苯胺-----+------++合計(jì)343136283325141813141512912

注：“+”表示樣品中檢測(cè)到該化合物質(zhì)，“-”表示樣品中未檢測(cè)到該化合物質(zhì)。

從表3分析看出，牦牛酥油中共鑒定出65種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類19種，酯類12種，烷類11種，酮類10種，醇類5種，醛類1種，其他類6種；其他類奶油樣品中共鑒定出41種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類9種，酯類8種，烷類4種，酮類10種，醇類1種，醛類3種，其他類5種。鑒定化合物中酸類和酯類所占比例最高。不同牦牛酥油的制備方法略有不同，所以揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類并不完全相同，但大多數(shù)含乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯3種酯類，而這些特征性酯類物質(zhì)在8種其他奶油類樣品中都未檢測(cè)到。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯可作為牦牛酥油特征性揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)的產(chǎn)生與牦牛酥油制備時(shí)特殊的發(fā)酵工藝密切相關(guān)[19-23]。可進(jìn)一步通過內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立酥油中這些特征揮發(fā)性物質(zhì)的定量方法，為牦牛酥油的鑒別和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

3.2 定量分析方法

3.2.1 萃取時(shí)間對(duì)定量結(jié)果影響

為了探究二氯甲烷萃取溶液是否將牦牛酥油中的特征揮發(fā)性物提取完全，對(duì)不同蒸餾萃取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化研究，分別研究1、2、3、4、5、6 h的效果。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在不同萃取時(shí)間的提取效果見圖2。

從圖2可看出，在1～4 h內(nèi)，乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的質(zhì)量濃度逐漸上升，4～6 h，曲線趨于平穩(wěn)，表明萃取4 h左右時(shí)，可將牦牛酥油中的這3種特征揮發(fā)性物質(zhì)提取完全，故本方法采用4 h蒸餾萃取。

3.2.2 線性關(guān)系和檢出限

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度1.0～50.0 μg/mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液濃度10.0 μg/mL，采用內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取20.0 g左右樣品，經(jīng)同時(shí)蒸餾萃取后定容至2.0 mL，根據(jù)S/N=3分別計(jì)算出這3種酯類的檢出限，乳酸乙酯0.13 μg/kg、辛酸乙酯0.18 μg/kg、癸酸乙酯0.17 μg/kg，詳見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性與檢出限Table 4 The standard curve and limit of detection

本方法線性關(guān)系R2≥0.997，線性關(guān)系良好；檢出限值低，靈敏度高。

3.2.3 準(zhǔn)確性和精密度

向酥油1樣品中分別加入0.05、0.02、0.01 mL乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL)，各做3份平行處理，實(shí)際加入量為高、中、低3個(gè)不同濃度：2.5、1.0、0.5 mg/kg，進(jìn)行回收率測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=3)Table 5 The recovery and relative standard deviation

從表4可以看出，乳酸乙酯回收率在86.7%～104.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.14%～1.37%；辛酸乙酯回收率在89.3%～105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.66%～1.37%；癸酸乙酯回收率在83.3%～89.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.59%～1.77%。

酥油1號(hào)樣品，同時(shí)蒸餾萃取處理5份，分析乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量，進(jìn)一步得到本方法測(cè)定的樣品的精密度，結(jié)果見表6。

表6 樣品分析相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=5)Table 6 The relative standard deviation of sample analysis

由表6可以看出，方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差乳酸乙酯為1.32%，辛酸乙酯為1.80%，癸酸乙酯為2.08%。本方法具有較好的線性關(guān)系，靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適合牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等特征揮發(fā)性成分的定量分析。

3.2.4 牦牛酥油特征性揮發(fā)性物質(zhì)定量分析

用戊酸乙酯做內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對(duì)酥油1、酥油2、酥油3、酥油4、酥油5和酥油6六種不同品質(zhì)的牦牛酥油樣品中的乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯進(jìn)行定量分析，為了更好的消除基質(zhì)干擾，準(zhǔn)確定量，根據(jù)這3種酯類保留時(shí)間和質(zhì)荷比的差異，采用SIM模式，分3個(gè)時(shí)間段(6～12 min、12～16 min、16～24 min)掃描，分別對(duì)化合物選擇1個(gè)定量和定性離子進(jìn)行分析，圖3為標(biāo)準(zhǔn)品和牦牛酥油樣品中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在SIM模式下的總離子流色譜圖。

A-標(biāo)準(zhǔn)品；B-樣品；1-戊酸乙酯(內(nèi)標(biāo))； 2-乳酸乙酯；3-辛酸乙酯；4-癸酸乙酯圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和牦牛酥油樣品SIM掃描離子流色譜圖Fig.3 The SIM chromatogram of standard and yak butter sample

用二氯甲烷同時(shí)蒸餾萃取處理牦牛酥油后，采用內(nèi)標(biāo)法定量分析，各樣品中乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量見表7。

表7 牦牛酥油特征揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 7 The content of characteristic volatile compounds in yak butter

可以看出，牦牛酥油中乳酸乙酯含量范圍在0.54～5.14 mg/kg；辛酸乙酯含量范圍在0.28～2.20 mg/kg；癸酸乙酯含量范圍在0.34～3.84 mg/kg，這與牦牛乳發(fā)酵制作酥油的特殊工藝和發(fā)酵時(shí)間的控制相關(guān)。

4 結(jié)論

利用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析對(duì)牦牛酥油進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)牦牛酥油中共鑒定出65種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類19種，酯類12種，烷類11種，酮類10種，醇類5種，醛類1種，其他類6種；其他類奶油樣品中共鑒定出41種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類9種，酯類8種，烷類4種，酮類10種，醇類1種，醛類3種，其他類5種。牦牛酥油樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量高于其他奶制品，且含有乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯這3種酯類，這些特征性酯類物質(zhì)在其他8種外形相似的奶制品中都未檢測(cè)到。作為牦牛酥油中含量較為豐富的特征揮發(fā)性物質(zhì)，乳酸乙酯味道濃厚，苦澀微甜；辛酸乙酯味甜，具有梨香、菠蘿的香味；而癸酸乙酯具有白蘭地醇香[24-31]。

對(duì)牦牛酥油復(fù)雜基質(zhì)中這3種特征酯類物質(zhì)，采用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行定量分析，建立了內(nèi)標(biāo)定量分析方法，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.997，線性范圍1.0～50.0 μg/mL；乳酸乙酯檢出限0.13 μg/kg、回收率86.7 %～104.7%；辛酸乙酯檢出限0.18 μg/kg、回收率89.3 %～105.7%；癸酸乙酯檢出限0.17 μg/kg、回收率83.3%～89.5%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值<2.1%。方法具有較好的線性,靈敏度、準(zhǔn)確性較高，可應(yīng)用在牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯特征揮發(fā)性成分分析中。本檢測(cè)方法具有操作簡單、試劑耗用量少、去除復(fù)雜樣品基質(zhì)干擾效果明顯等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)定6種牦牛酥油樣品，乳酸乙酯含量范圍在0.54～5.14 mg/kg，辛酸乙酯范圍在0.28～2.20 mg/kg，癸酸乙酯范圍在0.34～3.84 mg/kg。牦牛酥油與其他奶制品間揮發(fā)性物質(zhì)種類與含量存在較明顯的差異，該方法可為區(qū)分牦牛酥油與其他相似奶制品、以及評(píng)價(jià)不同酥油間的風(fēng)味品質(zhì)、改善加工工藝提供參考方法。