中青一號顆粒的提取工藝研究

張新剛，吳晶，賈忠，梁劍平

(1.甘肅德申科技發(fā)展有限公司，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050 3.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046；4.中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

菘藍(IsatisindigoticaFort.)系十字花科兩年生草本植物，其根、葉分別為傳統(tǒng)中藥材板藍根和大青葉。中青一號系菘藍新品種，2016年1月通過甘肅省農(nóng)作物品種審定委員會認定，取得甘肅省農(nóng)作物品種認定登記證書(甘認藥2016007)，并在蘭州、天水等地試種[1-2]。前期研究顯示中青一號干燥根中(R，S)-告依春含量約為《中國藥典》中板藍根規(guī)定含量的20倍以上，且遠高于其他市售板藍根藥材。故本研究以中青一號干燥根為原料代替板藍根，參照臨床驗方佐以蒲公英、紫菀、地丁等，開發(fā)成用于治療病毒性感冒的中藥制劑。采用正交設(shè)計，通過測定中青一號中有效成分(R，S)-告依春含量，建立并優(yōu)化中青一號顆粒(暫定名)提取工藝， 為中青一號的深加工和推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子天平(FA2004B，北京賽多利斯儀器公司)；超聲儀(型號：KH-500DE，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限司)；Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters 2998光電二極管陣列檢測器(美國Waters公司)。

1.2 藥材和試劑

中青一號干燥根(來源于蘭州榆中縣種植基地，批號161002);蒲公英(購自甘肅國草藥業(yè)有限公司，批號17101109)、紫菀、地丁等藥材(購自河北祁新中藥顆粒飲片，批號分別為20171201,20171001);(R，S)-告依春對照品(批號：111753-201706，購自中國食品藥品鑒定研究院)；板藍根對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121177-201608)，精氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：140685-201707)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司，批號：20171106)；茚三酮、乙醇、正丁醇和冰醋酸為分析純；乙腈，甲醇均為色譜純。

2 處方與制備工藝的設(shè)計優(yōu)化

2.1 (R，S)-告依春含量測定

2.1.1 色譜條件

十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：Waters XSELECT SSH-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：245 nm；柱溫：27℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈-水(15∶85)[3]。

2.1.2 溶液的制備

(1)對照品溶液的制備：取(R，S)-告依春對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

(2)供試品溶液的制備：取裝量差異項下的中青一號顆粒提取物適量，研細，精密稱定2.0 g，置100 mL的容量瓶中，加水50 mL，稱定重量，超聲提取60 min，放冷，用水補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 測定結(jié)果

按照上述色譜條件對對照品溶液和供試品溶液進行分析，結(jié)果顯示，供試品液和對照品色譜在相對應(yīng)保留時間位置處均出現(xiàn)色譜峰，方中其他成分對(R，S)-告依春的含量測定無干擾。

2.1.4 線性關(guān)系的考察

取(R，S)-告依春對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.16 mg的溶液，搖勻作為儲備液。精密吸取上述儲備溶液0.05、0.1、 0.2、0.4、0.6、1.0、1.2、1.4、1.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別進樣10 μL，測定峰面積，以對照品峰面積為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，得回歸方程y=8E+06x-36 213(r=0.999 6)，線性范圍為0.058～1.740 μg。

2.2 藥材吸水率測定試驗

按處方比例稱取中青一號干燥根(切小段)、蒲公英、紫菀、地丁等，共計100 g，測定吸水率。加水5倍量浸泡，以30 min為間隔觀察一次藥材浸透情況，記錄剩余水量(mL)，直至藥材浸透至心(判定標準：容器液面不再下降為止)，試驗結(jié)果見表1。

表1 全處方藥材吸水率考察結(jié)果表

試驗結(jié)果表明，全處方吸水率為125%。本試驗將加水量初定最低為藥材重量5倍，可將藥材完全浸透。

2.3 提取工藝單因素考察

2.3.1 浸泡時間的考察

按2.2方法稱取藥材，浸泡時間分別為30、60、90、120、150 min，固定加水量20倍，提取1次，提取時間2 h，測出膏率和(R，S)-告依春含量。結(jié)果顯示，出膏率和(R，S)-告依春含量隨浸泡時間相互差別不大，結(jié)合實際生產(chǎn)定為30 min。

2.3.2 提取時間的考察

按2.2方法稱取藥材，提取時間分別為30、60、90、120、150、180 min，固定浸泡時間1 h，加水量20倍，提取/次，測出膏率和(R，S)-告依春含量。結(jié)果顯示，隨提取時間增加，出膏率和(R，S)-告依春含量先增加后趨于穩(wěn)定。綜合實際生產(chǎn)，確定提取時間為120 min、150 min、180 min。試驗結(jié)果如表2。

表2 加水量單因素考察結(jié)果表

2.3.3 提取溶劑用量的考察

按2.2方法稱取藥材，提取加水量分別為10、14、18、22、26、30倍，固定浸泡時間1 h，提取1次，提取時間2 h，測出膏率和(R，S)-告依春含量。結(jié)果顯示，隨提取加水量增加出膏率逐漸增加而(R，S)-告依春含量先增加后穩(wěn)定。綜合以上，提取加水量定為18、22、26倍。 試驗結(jié)果如表3。

表3 加水量單因素考察結(jié)果表

2.3.4 提取次數(shù)的考察

按2.2方法稱取藥材，提取次數(shù)為1、2、3、4、5次，固定浸泡時間1 h，加水量20倍，提取時間2 h，測出膏率和(R，S)-告依春含量。結(jié)果顯示，隨提取次數(shù)的增加出膏率逐漸增加而(R，S)-告依春含量先增加后降低。綜合實際生產(chǎn)，提取次數(shù)定為1、2、3次。試驗結(jié)果如下表4。

表4 提取次數(shù)單因素考察結(jié)果表

2.4 正交試驗優(yōu)選水提工藝

2.4.1 全處方正交試驗設(shè)計

選取提取加水量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以(R，S)-告依春為指標設(shè)立L9(34)正交試驗設(shè)計表(見表5)，確立中青一號顆粒的水提工藝，試驗結(jié)果見表6、表7。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

注：P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著

由表6直觀分析，(R，S)-告依春含量的極差數(shù)據(jù)RA>RB>RD>RC，各因素作用主次為A>B >D。綜合表7方差分析結(jié)果可看出，因素A、B的P<0.01，對(R，S)-告依春含量的影響有統(tǒng)計學(xué)意義；而因素D的P>0.05，即提取次數(shù)對(R，S)-告依春含量影響無統(tǒng)計學(xué)意義。由此為了縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，最佳提取條件為A2B1D2，即以12、10倍水提取2次，每次提取時間為60 min。

2.4.2 提取工藝驗證試驗

為保證該提取工藝的穩(wěn)定性和中試生產(chǎn)的可操作，我們對正交試驗所得提取條件進行了3批次驗證實驗，以出膏率和(R,S)-告依春含量作為評價指標，驗證結(jié)果如表8。

表8 驗證結(jié)果表

取3批中青一號顆粒粉末0.75 g，加稀乙醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取板藍根對照藥材0.25 g，同法制成對照藥材溶液。再取精氨酸對照品，加稀乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。參照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)[4]試驗，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(20∶5∶5)為展開劑，展開，取出，熱風(fēng)吹干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點見圖1。

注:1.中青一號顆粒供試品(批號：20170322);2.中青一號顆粒供試品(批號：20170418);3.中青一號顆粒供試品(批號：20170516);4.板藍根對照藥材;5.精氨酸對照品圖1 中青一號顆粒薄層色譜圖

表8結(jié)果顯示，三批產(chǎn)品的出膏率和(R，S)-告依春含量相當。通過薄層色譜法(見圖1)對顆粒中的中青一號藥材進行鑒定，顯色斑點與板藍根對照藥材相一致。

3 討論

中青一號已在蘭州、天水等地試種，其畝產(chǎn)量超過當?shù)匕逅{根品種20%以上，經(jīng)測定靛玉紅含量可提高1倍以上[5]。該品種有耐旱、耐寒的特性，因此是適合黃土高原半干旱、半濕潤地區(qū)推廣的旱作栽培品種。中青一號顆粒由中青一號干燥根代替板藍根，與蒲公英、紫菀、地丁共同成方，經(jīng)提取、干燥、制軟材，最終制粒而來。其功效主要為清熱解毒、涼血利咽、消腫，用于由肺胃熱盛所引起的咽喉腫痛、嗓部痰多腮部腫脹。因組方中蒲公英、紫菀、地丁用量較少，主要以中青一號干燥根即板藍根的有效成分作為提取工藝的評價指標。板藍根含有多種活性成分，包括靛藍、靛玉紅、(R，S)-告依春等[6]。其中(R，S)-告依春的抗病毒作用報道最多，被認為與板藍根的清熱解毒作用直接相關(guān)[7-8]。此外，上述物質(zhì)水溶性較好，而本研究主要采取水提工藝，因此最終選擇其作為優(yōu)化提取工藝的評價指標。

本研究以中青一號顆粒的制劑工藝為研究對象，運用單因素和正交試驗設(shè)計方法，對處方中的中青一號水提工藝進行了工藝優(yōu)選。單因素試驗顯示：相較于浸泡時間，延長提取時間可以有效提高(R，S)-告依春的溶出。這是由于告依春有較好的水溶性，當外部濃度較低時，濃度差和滲透壓差可以促進(R，S)-告依春自藥材(即高濃度部位)向外溶出，當藥材內(nèi)外濃度達到平衡時則告依春再不溶出。其后在考察提取溶劑用量和提取次數(shù)時，也驗證了這一點。隨著提取溶劑量即加水量的增加，出膏率逐漸增加。而(R，S)-告依春含量之所以會出現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的情況是由于藥材內(nèi)、外濃度達到穩(wěn)態(tài)。增加提取次數(shù)可增加出膏率，但由于沒有新鮮的提取溶劑補充，(R，S)-告依春缺少溶出動力，外部溶劑中的含量不會再增加，反而出現(xiàn)減少。綜合單因素試驗，我們在正交試驗中將溶劑量、提取時間和提取次數(shù)作為主要影響因素，結(jié)果顯示溶劑量和提取時間對(R，S)-告依春的溶出具有顯著的影響，而提取次數(shù)的影響程度較小。結(jié)合實際放大生產(chǎn)經(jīng)驗和成本控制，最終確定最佳提取條件為以12、10倍水提取2次，每次提取時間為60 min。在之后的3批放大試驗中，我們看到以上述工藝條件提取的中青一號顆粒，每批的出膏率和(R，S)-告依春含量變化不大，提示優(yōu)化的提取工藝適用于放大生產(chǎn)過程。同時，薄層色譜法也顯示該顆粒中的中青一號藥材的斑點與板藍根對照藥材相一致，這為中青一號的開發(fā)、推廣提供了依據(jù)。