不同天然居群小蓬竹的遺傳多樣性

管睿婷 劉濟(jì)明 王 敏 陳敬忠 武夢(mèng)瑤 童炳麗

(貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

小蓬竹(Petrocalamusluodianensis(Yi et R.S.Wang) Z.P.Wang et W.Y.Zhang)禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)巖竹屬(Petrocalamus)[1～2]；竹竿低部位較直且中心空隙很小，高部位藤狀垂掛，合軸叢生，主干粗壯而側(cè)枝極細(xì)，籜鞘較晚掉落，籜片披針形，沒(méi)有籜耳；中國(guó)特有、貴州省特有物種，現(xiàn)悉僅分布于貴州省羅甸縣、平塘縣、長(zhǎng)順縣、紫云縣、貞豐縣、冊(cè)亨縣、望謨縣、安龍縣、惠水縣等喀斯特區(qū)域600～1 000 m海拔高度的石灰?guī)r出露山地，在《中國(guó)物種紅色名錄》、《IUCN紅色名錄》里均屬極危種[3]。

小蓬竹具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、社會(huì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。其材質(zhì)柔韌，極適于編織農(nóng)具、涼椅等，竹稈適做棚架和籬笆等；形態(tài)優(yōu)美，是良好的園林綠化竹種，城市及公路邊坡綠化美化中也可用作觀賞植物；小蓬竹的竹漿質(zhì)優(yōu)，是造紙的上好材料。據(jù)劉超等[4]對(duì)小蓬竹水土保持效應(yīng)的研究，小蓬竹林冠能截留大量降水，枯落物有助于土壤理化性質(zhì)改善，能有效增強(qiáng)土壤的固土、保水、保肥能力。另外，洛暢等[5]發(fā)現(xiàn)空氣相對(duì)濕度、葉片溫度與明氣孔導(dǎo)度等生態(tài)因子操控著小蓬竹水分利用率的日變化，李麗霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)移栽小蓬竹與野生植株最大凈光合速率無(wú)顯著差異，李鵬等[7]研究表明小蓬竹根際土壤中微生物極為豐富。池馨等[8]研究證明若環(huán)境資源有限，小蓬竹與生態(tài)位相似性高的植物間競(jìng)爭(zhēng)激烈，其建群種地位將備受威脅，故引種需盡量避免同女貞、榆樹(shù)、云實(shí)、黃連木、欏木石楠等植物共植。孟勇等[9]研究了小蓬竹的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，蒙朝陽(yáng)對(duì)小蓬竹進(jìn)行了扦插、埋稈埋節(jié)、連續(xù)分株、壓條等試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小蓬竹育苗的成活率受到插條年齡、生長(zhǎng)素類(lèi)型及其濃度的影響，其最優(yōu)扦插條件下成活率僅50%左右。微觀領(lǐng)域馬玉棟等[10]用石蠟切片法研究了小蓬竹根、莖、葉結(jié)構(gòu)，Zhou等[11]在研究轉(zhuǎn)座子特性時(shí)使用小蓬竹作為試驗(yàn)材料。

過(guò)去對(duì)小蓬竹的研究主要集中于生態(tài)學(xué)與發(fā)育繁殖生理等方面，而對(duì)于小蓬竹的遺傳特性及不同居群間的遺傳變異研究未見(jiàn)報(bào)道。故該研究可為我國(guó)特有、極危物種小蓬竹的保護(hù)和后續(xù)開(kāi)發(fā)利用及相關(guān)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

多次在貴州省內(nèi)進(jìn)行小蓬竹野外分布調(diào)查的同時(shí)進(jìn)行采樣，共采集到16個(gè)居群(表1)，每個(gè)群體各取3株個(gè)體的新鮮葉片，用變色硅膠快速干燥。具體操作為：采集幼嫩、新鮮葉片約10 g置于塑封袋中，加入100 g變色硅膠，搖動(dòng)袋子使葉片充分接觸硅膠，保證葉片在12 h內(nèi)干燥。隨時(shí)注意觀察硅膠顏色，一旦由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，便隨即更換處理。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器

(1)MJ Mini Personal Thermal Cycler PTC-1148(美國(guó)BIO-RAD)；

(2)Centrifuge 5418小型臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)；

(3)DYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源(北京市六一儀器廠)；

(4)DYCP-31E瓊脂糖水平電泳槽(北京市六一儀器廠)；

(5)HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；

(6)SE202F電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；

(7)移液槍一套(德國(guó)Eppendorf)；

(8)UV VIS 8500紫外分光光度計(jì)(美國(guó)BIO-RAD)；

(9)凝膠成像儀器(美國(guó)BIO-RAD)；

(10)自動(dòng)蒸汽滅菌鍋(常州澳華儀器有限公司)。

1.2.2 主要試劑

CTAB提取液：CTAB提取液CTAB 2%，PVP(MW 40000)2%，NaCl 1.4 mol·L-1，EDTA pH8.0 20 mmol·L-1，TrisHCl pH8.0，100 mmol·L-1；

5×TBE電泳緩沖液：54 g Tris堿，27.5 g硼酸，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA(pH7.9)，加ddH2O定容至1 000 mL，使用的時(shí)候稀釋5倍；

TE buffer：10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1M EDTA，pH8.0；

100 bp Plus DNA Ladder(Thermo Scientific上海)；6×Loading buffer，Taq DNA酶，dNTP，4S Green無(wú)毒型核酸染色劑，RAPD隨機(jī)引物購(gòu)自上海生工。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小蓬竹基因組DNA的提取與檢測(cè)

DNA的提?。涸贒oyle J J和Doyle J L經(jīng)典的CTAB法[12]基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，從硅膠干燥的小蓬竹葉片中提取小蓬竹基因組DNA，具體操作步驟為：

(1)取0.05 g干燥葉片置于滅菌預(yù)冷的研缽中，加適量的液氮快速研磨至粉末，研磨過(guò)程中注意添加液氮，在完成研磨前不能讓研缽中的液氮完全揮發(fā)，以防止DNA褐化和降解。將研磨好的組織粉末迅速分裝至2.0 mL滅菌冷凍的離心管中。

(2)加入800 μL 65℃預(yù)熱的2×CTAB提取液，10 μL的β-巰基乙醇，劇烈震蕩以充分混勻，置于65℃水浴約1 h，每10 min顛倒搖勻1次。

(3)加800 μL的氯仿∶異戊醇(24∶1)，緩慢顛倒搖晃10 min。

(4)10 000 rcf，低溫離心10 min。

(5)取上清液到一支新的離心管，加入0.7體積預(yù)冷的異丙醇，150 μL醋酸鈉(pH5.2)，充分混勻，-20℃放置30 min。

(6)10 000 rcf，低溫離心10 min。

(7)棄上清，用70%酒精清洗沉淀1次。

(8)棄去酒精，在空氣中晾干沉淀，加入50 μL 65℃預(yù)熱的TE buffer溶解沉淀，-20℃放置備用。

模板DNA的檢測(cè)：

馬克思人的解放理論，不僅為我們深刻理解和把握美好生活的內(nèi)涵提供了理論坐標(biāo)，而且也為我們探尋美好生活的實(shí)現(xiàn)路徑提供了根據(jù)遵循。依據(jù)該理論，我們認(rèn)為，美好生活的生成蘊(yùn)含著以下三重邏輯。

(1)瓊脂糖電泳檢測(cè)模板DNA

按照0.08%濃度稱(chēng)取瓊脂糖粉末于TBE buffer中，微波爐加熱溶解，待冷卻至60℃時(shí)加入10%的核酸染液Green 4S混勻后，倒膠。

取6 μL模板DNA和3 μL 6×loading buffer混勻，在濃度0.08%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳液為1×TBE，電壓100 V。待溴酚藍(lán)跑至離點(diǎn)樣孔2/3處時(shí)停止電泳。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照，據(jù)此確定DNA的濃度、片段大小、有無(wú)降解、RNA和蛋白質(zhì)的污染情況等等。以確定所提取DNA的濃度和純度。

(2)模板DNA的紫外吸收檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA。用ddH2O對(duì)待測(cè)樣品DNA稀釋至3 mL，以ddH2O作為參比液進(jìn)行調(diào)零，在紫外分光光度儀上分別測(cè)定波長(zhǎng)230，260和280 nm處的OD值。

核酸在260 nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在280 nm處吸收峰最大，鹽和小分子的最大吸收峰在230 nm處。260 nm處的讀數(shù)來(lái)計(jì)算待測(cè)核酸的濃度，A260/A280比值大小說(shuō)明樣品中殘存蛋白質(zhì)的多少，A260/A230比值說(shuō)明樣品中殘存核苷酸、氨基酸、酚、鹽等小分子雜質(zhì)。根據(jù)A260/A280和A260/A230來(lái)判斷DNA的純度，根據(jù)A260計(jì)算DNA的濃度和得率，公式為：

DNA濃度(ng·μL-1)=50×A260×稀釋倍數(shù)

DNA得率(ng·g-1)=DNA濃度×葉片量(g)

1.3.2 引物篩選

1.3.3 RAPD擴(kuò)增

運(yùn)用優(yōu)化的RAPD-PCR最佳反應(yīng)體系[13]和所篩選的引物，對(duì)所有小蓬竹居群的樣品DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳液為1×TBE，電壓100 V，待溴酚藍(lán)跑至距離點(diǎn)樣孔2/3處時(shí)停止電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照記錄。

表2 RAPD引物編號(hào)及序列

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

RAPD是顯性標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率相同的條帶被認(rèn)為具有同源性，屬于同一位點(diǎn)的產(chǎn)物，按照有帶為1，無(wú)帶為0來(lái)記錄電泳譜帶。將每個(gè)位點(diǎn)視為等位基因M和m，數(shù)據(jù)“1”代表基因型MM或Mm，數(shù)據(jù)“0”代表基因型mm，并且假定居群內(nèi)基因頻率處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，用POPGENE32[14]軟件計(jì)算下列遺傳參數(shù)：

(1)多態(tài)位點(diǎn)比例(percentage of polymorphic loci，PPL)

PPL=(具有多態(tài)的位點(diǎn)/檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù))×100%

(1)

(2)觀測(cè)等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)

(3)有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)

(2)

式中：ne為單個(gè)位點(diǎn)上的有效單位基因數(shù)；Pi為單個(gè)位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因頻率；n為測(cè)定位點(diǎn)總數(shù)；Ne與基因的頻率大小聯(lián)系起來(lái)，更能反應(yīng)群體的真實(shí)情況。

(4)Shannon’s多樣性指數(shù)(Shannon’s Information index,I)

I=-∑Pilog2Pi

(3)

式中：Pi是一條擴(kuò)增產(chǎn)物存在的頻率；I為表型多樣性指數(shù)。

I可以計(jì)算兩種水平的多樣性：Hpop和Hsp。Hpop是群體內(nèi)遺傳多樣度，Hsp是種內(nèi)遺傳多樣性，Hpop/Hsp則是群體內(nèi)多樣性所占的比例，群體間多樣性所占比例則為(Hpop-Hsp)/Hsp。

(5)Nei’s基因多樣性(Nei’s gene diversity,H)

(6)群體總基因多樣性(Ht)和群體內(nèi)基因多樣性(Hs)；

(7)基因分化系數(shù)(coefficient of gene differentiation，Gst)

Gst=(Ht-Hs)/Ht

(4)

(8)基因流(gene flow，Nm)

Nm=(1-Gst)/2Gst

(5)

(9)遺傳相似性系數(shù)(genetic identity)

(6)

又表示兩群體間的遺傳相似程度，式中：JX、JY和JXY分別是所有位點(diǎn)上JX、JY和JXY算術(shù)平均數(shù)。這里JX=∑Xi，JY=∑Yi，JXY=∑XiYi，Xi、Yi分別是X、Y群體中第i個(gè)等位基因。

(10)Nei’s遺傳距離(D)(genetic distance)

D=-lnI

(7)

用NTSYSpc Version 2.10e軟件利用UPGMA(非加權(quán)算術(shù)平均法，unweighted pair group with arithmetic average)進(jìn)行聚類(lèi)分析，并建立聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取與檢測(cè)

采用改良CTAB方法提取到較高純度的小蓬竹基因組DNA，0.08%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1)所提取的基因組DNA主帶清晰，略有拖尾現(xiàn)象但不影響RAPD分析。所提取的小蓬竹基因組DNA的A260/A280比值在1.75～1.79，純度較高；干燥葉片的DNA得率在2.17～5.27 μg·g-1，已經(jīng)達(dá)到RAPD分析下游試驗(yàn)的要求。

圖1 部分小蓬竹樣品DNA電泳結(jié)果Fig.1 The DNA electrophoresis result of P.luodianensis

2.2 隨機(jī)引物篩選

選取質(zhì)量比較好的基因組DNA樣品為模板篩選引物，從上海生工購(gòu)買(mǎi)的80條隨機(jī)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高，穩(wěn)定性好的8條隨機(jī)引物用于小蓬竹RAPD分析(表3)。部分引物篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖2。

表3 用于小蓬竹RAPD分析的隨機(jī)引物序列和編號(hào)

Table 3 Sequences and codes of RAPD primes forP.luodianensis

引物編號(hào)Primers’ number序列(5'—3')Sequence引物編號(hào)Primers’ number序列(5'—3')SequenceS5TGCGCCCTTCS101GGTCGGAGAAS43GTCGCCGTCAS123CCTGATCACCS60ACCCGGTCACS130GGAAGCTTGGS94GGATGAGACCS431TCGCCGCAAA

圖2 部分引物篩選瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of some primers’ selection

表4 小蓬竹RAPD擴(kuò)增結(jié)果

2.3 小蓬竹物種和居群水平的遺傳多樣性

本試驗(yàn)從80個(gè)引物中篩選出8個(gè)RAPD隨機(jī)引物，對(duì)16個(gè)小蓬竹居群的48個(gè)DNA樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出105清晰、重復(fù)性高的條帶，分子量約為200～3 000 bp，其中多態(tài)性條帶有97條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPL)為92.38%。平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出12.25條多態(tài)性條帶，其中引物S5、S43、S431擴(kuò)增的條帶數(shù)最多(16條)，S123擴(kuò)增條帶數(shù)最少(7條)；S43、S101、S431擴(kuò)增條帶多態(tài)性位點(diǎn)百分率達(dá)100%(表4，圖3)。Shannon’s多樣性指數(shù)(I)為0.458 6，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.300 5，有效等位基因數(shù)(Na)為1.494 2，由此可見(jiàn)，小蓬竹物種水平遺傳多樣性較為豐富。

從居群水平上分析，落灣(ZY1)居群多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)最高(60.95%)，桃坡(PT1)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率最低(44.76%)，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)平均值為57.00%(表5)。按多態(tài)位點(diǎn)比率(PPL)排序，各個(gè)居群遺傳多樣性高低的順序?yàn)椋郝錇?ZY1)>興活(WM2)>格我(HS1)>八坎(AL1)>冗雷(CS1)>董架(LD1)>天生橋(HS2)>上壩(HS3)>山花(WM1)>楊柳樹(shù)(ZF1)>打擁(LD2)>冗染(ZF2)>沙壩(CH2)>馬熊灣(CH1)>冗渡(CH3)>桃坡(PT1)。

Shannon’s多樣性指數(shù)(I)最高的是落灣(ZY1)居群為0.345 1，最低的是桃坡(PT1)居群為0.252 3，平均值為0.301 4(表5)。16個(gè)居群排序?yàn)槁錇?ZY1)>興活(WM2)>格我(HS1)>冗雷(CS1)>天生橋(HS2)>八坎(AL1)>山花(WM1)>董架(LD1)>上壩(HS3)>楊柳樹(shù)(ZF1)>打擁(LD2)>冗渡(CH3)>冗染(ZF2)>馬熊灣(CH1)>沙壩(CH2)>桃坡(PT1)。

圖3 引物S5、S43、S431擴(kuò)增小蓬竹16個(gè)居群的RAPD指紋圖譜Fig.3 RAPD fingerprintings from S5、S43、S431 primers PCR amplification of 16 populations of P.luodianensis

圖4 16個(gè)居群小蓬竹的遺傳變異指數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.4 The genetic variation indices of 16 P.luodianensis populations

Nei’s基因多樣性(H)最高的是落灣(ZY1)居群為0.232 9，最低的是桃坡(PT1)居群為0.170 0，平均值0.203 4(表5)。以Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)(表5)為指標(biāo)，則16個(gè)小蓬竹居群遺傳多樣性順序?yàn)椋郝錇?ZY1)>興活(WM2)>格我(HS1)>天生橋(HS2)>冗雷(CS1)>山花(WM1)>八坎(AL1)>董架(LD1)>楊柳樹(shù)(ZF1)>上壩(HS3)>冗渡(CH3)>打擁(LD2)>馬熊灣(CH1)>冗染(ZF2)>沙壩(CH2)>桃坡(PT1)。

分別以居群多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)、Shannon’s多樣性指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性(H)為指標(biāo)評(píng)價(jià)的各個(gè)居群遺傳多樣性變化趨勢(shì)相似(圖4)。

2.4 小蓬竹居群的遺傳分化

根據(jù)Nei’s基因多樣性指數(shù)估算的小蓬竹16個(gè)小蓬竹居群間的基因分化系數(shù)(Gst)為0.323 1(表6)，即居群間變異占總的遺傳變異的32.31%，居群內(nèi)變異占的比例為67.69%。使用Shannon’s多樣性指數(shù)分析的居群間遺傳多樣性所占比例[(HSP-HPOP)/HSP]為0.342 9，即居群間變異占總的遺傳變異的34.29%，居群內(nèi)變異占的比例為65.71%。Shannon’s多樣性指數(shù)分析的居群間遺傳多樣性所占比例略大于Gst估算的遺傳分化系數(shù)，但是，兩類(lèi)指數(shù)估算的小蓬竹居群遺傳分化結(jié)果是一致的，都是以居群內(nèi)遺傳變異為主。

2.5 小蓬竹居群間的遺傳距離和聚類(lèi)分析

基因分化系數(shù)只能評(píng)估居群間的分化程度，不能定量分析居群間的遺傳分化，因此計(jì)算出居群間的遺傳相似性(I)和遺傳距離(D)(表7)，這兩者是評(píng)價(jià)居群內(nèi)和居群間遺傳變異水平的重要指標(biāo)。居群間遺傳相似系數(shù)(I)在0.816 0～1.034 7，說(shuō)明居群間的親緣關(guān)系很近。16個(gè)小蓬竹的遺傳距離都不夠高，遺傳距離最大的為沙壩(CH2)和八坎(AL1)兩居群間，也只有0.203 3；冗雷(CS1)和(HS1)格我兩個(gè)居群間遺傳距離為負(fù)值(-0.034 1)，進(jìn)一步說(shuō)明居群間的遺傳變異程度較低。

表5 小蓬竹16個(gè)居群遺傳多樣性

表6 小蓬竹居群的遺傳分化

圖5 基于RAPD標(biāo)記的16個(gè)小蓬竹天然居群UPGMA聚類(lèi)圖Fig.5 UPGMA dendrogram for 16 natural populations of P.luodianensis based on RAPD markers

Table 7 Nei’s unbiased measures of genetic identity(above diagonal) and genetic distance(below diagonal) among 16P.luodianensispopulations

種群PopulationsLD1LD2PT1ZF1ZF2CH1CH2CH3WM1WM2ZY1CS1HS1HS2HS3AL1LD1****0.97360.97850.86780.89380.88080.86120.90920.94330.98890.98900.99730.99470.98490.97350.9501LD20.0268****0.92360.89180.91240.86730.89780.88150.88290.94810.92740.92840.94280.91820.92110.9031PT10.02170.0795****0.86260.85930.89020.85150.91230.94530.97180.94960.95140.95350.94860.94740.8978ZF10.14180.11450.1478****0.96810.91860.87560.94360.88000.88330.86990.86290.88630.87000.85880.8689ZF20.11230.09160.15160.0325****0.91620.91080.92790.86970.88470.87430.87030.88420.86430.86470.8638CH10.12690.14230.11630.08490.0876****0.87660.92440.86880.89450.87400.87070.88920.85640.86870.8384CH20.14940.10780.16080.13290.09350.1317****0.89640.86010.84460.82420.81950.84140.83010.84170.8160CH30.09520.12620.09180.05810.07490.07860.1093****0.90410.90940.89840.89280.92000.90370.90520.8801WM10.05840.12460.05620.12780.13970.14060.15070.1008****0.98580.96010.94690.94090.95380.95820.8803WM20.01110.05330.02860.12410.12250.11150.16900.09500.0144****1.00900.98430.98390.97341.01140.9140ZY10.01110.07540.05170.13930.13430.13470.19330.10710.0408-0.0089****1.03021.02701.01561.00120.9290CS10.00270.07430.04980.14750.13890.13840.19900.11340.05450.0158-0.0298****1.03471.00400.99270.9309HS10.00530.05890.04760.12070.12300.11750.17260.08340.06090.0163-0.0267-0.0341****1.01450.99160.9504HS20.01530.08540.05270.13920.14580.15500.18620.10130.04730.0270-0.0155-0.0040-0.0144****0.97290.9585HS30.02680.08210.05410.15220.14540.14070.17240.09960.0427-0.0113-0.00120.00730.00850.0275****0.9109AL10.05120.10200.10790.14050.14640.17630.20330.12780.12750.09000.07360.07160.05080.04240.0933****

根據(jù)Nei’s相似性和遺傳距離使用NTSYSpc V2.10e軟件利用UPGMA法構(gòu)建了居群遺傳關(guān)系的聚類(lèi)圖。由圖5分析，居群ZF1(楊柳樹(shù))和ZF2(冗染)相聚后再先后與居群CH3(冗渡)、居群CH1(馬熊灣)相聚，然后與居群CH2(沙壩)相聚，這5個(gè)居群形成一個(gè)分支；居群CS1(冗雷)與HS1(格我)相聚后與居群ZY1(落灣)相聚，然后一起再先后與居群HS2(天生橋)及LD1(董架)相聚，然后與已經(jīng)相聚的居群WM2(興活)和HS3(上壩)相聚，再先后與居群PT1(桃坡)、WM1(山花)、LD2(打擁)、AL1(八坎)相聚成另一個(gè)分支。聚為一類(lèi)者親緣關(guān)系較近。

3 討論

3.1 小蓬竹基因組DNA的提取

植物基因組DNA的提取方法，除了經(jīng)典CTAB法[15]和SDS法[16]外，近些年又發(fā)展出一些簡(jiǎn)化、快速的制備方法，如SDS一步法制備PCR模板、微量提取法[17]等。目前用于竹類(lèi)植物基因組DNA提取的方法主要以CTAB法和SDS法為基礎(chǔ)。蔣瑤等[18]使用改良SDS法提取了撐篙竹(Bambusapervariabilis)和梁山慈竹(Dendrocalamusfarinosus)基因組DNA；楊清用CTAB裂解—硅珠吸附法提取了篌竹(Phyllostachysnidularia)和版納甜龍竹(Dendrocalamushamiltonii)的DNA。

通常在提取植物基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量采用新鮮材料，以便于維持DNA的結(jié)構(gòu)完整和生理活性狀態(tài)，超低溫冷凍是最好的保持組織成分的有效方法。但在野外采集樣品時(shí)，要及時(shí)冷凍和運(yùn)輸大量新鮮材料是一件很困難的事情。所以，本研究中采用的硅膠快速干燥植物葉片的方式采集和保存植物材料，用干燥的植物葉片提取DNA。硅膠干燥植物葉片的方法是由Chase & Hills[19]提出的，該方法實(shí)現(xiàn)了野外大規(guī)模采樣。本試驗(yàn)在提取小蓬竹基因組DNA的過(guò)程中驗(yàn)證：從干燥葉片與新鮮葉片中提取DNA的效果完全一致。

本研究選用的RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量要求不高，但小蓬竹葉片中蛋白質(zhì)和多糖含量較高，對(duì)DNA提取影響極大，因此本研究選擇在經(jīng)典CTAB法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，最后得到適合提取小蓬竹基因組DNA的方法。本試驗(yàn)還進(jìn)行了兩點(diǎn)加強(qiáng)的步驟，一是研磨前用剪刀將葉片剪碎，去除葉柄和葉主脈部分；二是研磨完成前不能讓研磨缽中的液氮完全揮發(fā)，要保持葉片在液氮的冷凍保護(hù)中。

3.2 小蓬竹的遺傳多樣性與遺傳分化

諸多研究發(fā)現(xiàn)，一些特有和瀕危物種具有較高的遺傳多樣性[20]，比如瀕危竹類(lèi)筇竹(Chimonobambusatumidissinoda，PPL=70.08%)、大葉筇竹(Chimonobambusamacrophylla，PPL=76.40%)、溪岸方竹(Chimonobambusarivularis，PPL=57.20%)、珍稀瀕危觀賞竹筇竹(QiongzhueatumidinodaPPL=76.38%)[21]；瀕危特有種掌葉木(Handeliodendronbodinieri)的多態(tài)性信息指數(shù)I=0.962[22]；孑遺瀕危植物蒙古沙冬青(AmmopiptanthusmongolicusPPL=73%)[23]。本研究表明，小蓬竹物種水平PPL為92.38%，Shannon’s信息指數(shù)I為0.458 6，Nei’s遺傳多樣性H為0.300 5，大于單子葉植物的平均值(0.190 9)，說(shuō)明極危物種小蓬竹也具有較高的遺傳多樣性。

植物的遺傳多樣性受許多因素影響，如起源早晚、進(jìn)化歷史、分類(lèi)位置、生活型、地理分布、繁育系統(tǒng)等[24]。遺傳變異高的植物通常是壽命長(zhǎng)、地理分布廣、異交為主、風(fēng)媒授粉、結(jié)實(shí)率高且存在于演替階段末期的物種。有研究表明無(wú)性繁殖的植物也具有與有性繁殖植物同樣的高的遺傳變異水平，比如無(wú)性繁殖植物沙鞭(Psammochloavillosa)具有91.67%特異性基因型，其居群間遺傳分化系數(shù)Gst為62.16，居群間具有很高的遺傳變異[25]。小蓬竹系無(wú)性繁殖為主，本研究認(rèn)為它表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性的原因可能是：一，在進(jìn)化過(guò)程中保留了廣泛的遺傳基礎(chǔ)，或在后期的自然選擇中產(chǎn)生了豐富的遺傳變異；二，體細(xì)胞突變，體細(xì)胞突變是無(wú)性繁殖為主的植物遺傳變異的一個(gè)持續(xù)來(lái)源，以體細(xì)胞突變的高發(fā)生率補(bǔ)償重組的缺失，從而適應(yīng)環(huán)境的變化。

從單個(gè)居群來(lái)看，基于PPL、Nei’s基因多樣性H、Shannon’s多樣性指數(shù)分析的居群遺傳多樣性結(jié)果是一致的，即落灣(ZY1)居群的遺傳多樣性水平最高(PPL=60.95%，H=0.232 9)，桃坡(PT1)居群遺傳多樣性水平最低(PPL=44.76%，H=0.170 0)。作者實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)，所有居群都受到不同程度的自然或人為的破壞。在遺傳多樣性較高的落灣居群，小蓬竹曾經(jīng)大片分布，生長(zhǎng)狀況良好。但在本試驗(yàn)組到落灣采樣的前一年，當(dāng)?shù)卦庥隽舜蠛担善∨钪袢彼滤?，已由過(guò)去的滿山分布變成現(xiàn)在的斑點(diǎn)分布。若不及時(shí)維護(hù)，其種群數(shù)量可能越來(lái)越??；相反，遺傳多樣性最低的桃坡居群是在平塘景區(qū)內(nèi)且鄰水，生境條件相對(duì)優(yōu)越。生境惡劣的居群遺傳多樣性高，生境優(yōu)越的居群遺傳多樣性低，這種情況可能是小蓬竹主要進(jìn)行無(wú)性繁殖造成的。小蓬竹為一次性開(kāi)花竹種，主要進(jìn)行無(wú)性繁殖，只有環(huán)境極端時(shí)才會(huì)開(kāi)花。但是生境若得不到及時(shí)改善，即使形成種子也難以恢復(fù)被破壞的種群。

遺傳分化系數(shù)是居群間的遺傳變異與總遺傳變異的比值，是判斷遺傳變異的主要來(lái)源。小蓬竹基于Nei’s多樣性指數(shù)的基因分化系數(shù)Gst為0.323 1，略低于基于Shannon’s多樣性指數(shù)估計(jì)的分化系數(shù)0.342 9，但均說(shuō)明：小蓬竹居群內(nèi)的遺傳多樣性比居群間的遺傳多樣性高。同時(shí)由于地理隔離，小蓬竹居群間存在一定的遺傳分化。

基因流是影響居群內(nèi)部和居群間遺傳變異程度的重要因素[26]，一般，較大基因流能夠阻止居群間的遺傳分化，即基因流大的物種，居群間的遺傳分化就小，而小基因流的物種，種群間的遺傳分化就大。當(dāng)Nm>1時(shí)，說(shuō)明種群間存在一定的基因流動(dòng)[27]。本試驗(yàn)結(jié)果分析顯示，小蓬竹居群水平上的基因流(Nm)為1.047 8>1，說(shuō)明小蓬竹居群間存在基因流動(dòng)，居群間的遺傳分化較小，這與實(shí)驗(yàn)所得居群間、居群內(nèi)的遺傳多樣性和遺傳分化系數(shù)分析結(jié)果相一致。而本實(shí)驗(yàn)所用小蓬竹材料為小蓬竹野外天然林，表明小蓬竹存在自然的有性繁殖現(xiàn)象，且小蓬竹主要分布在喀斯特高山山區(qū)，花粉可借助風(fēng)力遠(yuǎn)距離傳播，以實(shí)現(xiàn)小蓬竹居群間一定程度的基因交流，這也是小蓬竹居群間遺傳分化小于種群內(nèi)的一個(gè)重要原因。