毛酸漿(Physalis pubescens)花形態(tài)特征與小孢子發(fā)育

馮學(xué)超 陳露露 杜可玉 李勇鵬 趙凌俠*

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院植物生物技術(shù)研究中心，上海 200240； 2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院番茄聯(lián)合研究中心，上海 200240)

雄蕊是開花(flowering plant)/被子(Angiosperms)植物花雄性生殖器官，與植物繁殖、物種延續(xù)、果實發(fā)育及產(chǎn)量形成密切相關(guān)；其雄性配子體發(fā)育經(jīng)歷了造孢細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、小孢子發(fā)育成成熟花粉生物學(xué)過程[1]。盡管模式植物擬南芥(Arabidopsisthalina)、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatabacum)和番茄(Solanumlycopersicum)小孢子發(fā)育已進(jìn)行廣泛的研究[2～8]，而物種間遺傳背景和進(jìn)化方式的差異必將表現(xiàn)出小孢子發(fā)育的多樣性。茄科毛酸漿(Physalispubescens)與模式植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其小孢子發(fā)育與番茄差異將為深入研究茄科植物花發(fā)育提供重要參考；特別是花萼膨大成“燈籠形”包被果實這一獨特的生物學(xué)特性可以免遭環(huán)境污染或損傷。毛酸漿作為半野生水果風(fēng)味獨特，富含多糖、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素類、類胡蘿卜素、生物堿和酸漿苦素；還具有抗氧化、降壓、利尿、抗菌、鎮(zhèn)痛、消炎、強(qiáng)心、催產(chǎn)、降血脂和抗癌等臨床功效[9～14]?！侗静菥V目》記載：“酸漿利濕除熱。利濕故能化痰治疽，除熱故清肺治咳”。

基于此，本研究采用比較生物學(xué)方法解析毛酸漿(P.pubescens)與番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)花形態(tài)特征和小孢子發(fā)育，以期為深入研究毛酸漿及揭示茄科植物花發(fā)育提供一些信息。

1 材料方法

1.1 植物材料

毛酸漿(Physalispubescens)系黑龍江省(121°11′～135°05′E，43°26′～53°33′N)地方品種，種子是購自哈爾濱市鮮果剖取陰干后所得；櫻桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiformeNo.22)種子保存于上海交通大學(xué)番茄聯(lián)合研究中心。溫湯(45℃)浸種60 min，室溫浸種8 h，26℃育苗箱催芽。待種子露白(胚芽初現(xiàn))播種于裝有濕潤育苗土60孔育苗穴盤(1粒/穴)；4片真葉展開時小苗定植于上海交通大學(xué)浦江綠谷基地日光溫室，正常水肥管理。

1.2 取樣和組織切片制備

從-11～0 dpa(開花當(dāng)日days post anthesis)每天上午8～10時取毛酸漿花蕾/花朵，以櫻桃番茄為參照。用電子游標(biāo)卡尺(CD-15CPX,Mitutoyo,Japan)測量花器大小，用相機(jī)(Canon，EOS 800D，Japan)拍照。為了觀察小孢子發(fā)育，將不同發(fā)育期花蕾在FAA液(37%甲醛∶冰醋酸∶無水乙醇∶雙蒸水=v∶v∶v∶v=5∶5∶63∶27)中固定，抽真空更換新FAA液4℃保存。梯度乙醇脫水(70%、80%、95%)30 min，無水乙醇脫水2 h；曙紅(上海源葉生物有限公司，上海)乙醇飽和溶液著色。樣品預(yù)滲透(無水乙醇：Basne Luqizd Technoovt 7100=v∶v=1∶1)2 h；25℃條件滲透(1 g硬化劑Ⅰ溶于100 mL Basne Luqizd Technoovt 7100中,Kulzer and Co.,Wehrheim,Germany)過夜。在灌注包埋液(硬化劑Ⅱ∶滲透液=v∶v=1∶14)包埋板上包埋樣品；48℃加熱10 min，60℃烘箱中硬化48 h。用半薄切片機(jī)(Leica RM2265，Germany)切成厚3 μm切片。蒸餾水展片，酒精燈烘干殘余水粘片于載玻片。用1%甲苯胺藍(lán)水溶液(甲苯胺藍(lán)∶硼酸∶雙蒸水=w∶w∶v=1∶1∶100，Toluidine Blue O，TBO)染色40 s，雙蒸水洗去殘余染液；烘干后滴加中性樹膠加蓋玻片通風(fēng)櫥中過夜風(fēng)干；中性樹膠封片，在顯微鏡(Nikon Eclipse 80i,USA)下觀察小孢子發(fā)育并拍照。

2 結(jié)果分析

2.1 花形態(tài)特征

毛酸漿(P.pubescens)為單花腋生，比櫻桃番茄花小，番茄系復(fù)總狀花序，假二叉分枝(圖1:a，e)。毛酸漿花萼基部相連，中裂成“鐘”狀(圖1:c，i)；櫻桃番茄花萼深裂至基部，均為綠色花萼(圖1:d，k)。毛酸漿5枚淡黃色花瓣交疊呈“五角星”花冠，花瓣有紫色“眼狀”斑紋，并與花藥齊平(圖1:b，i)。櫻桃番茄“披針”花瓣深裂基部相連，黃色(圖1:e～f，k)。毛酸漿淡紫花藥借助花絲著生于花瓣基部，頂頸可育，背部開裂散粉(圖1:b，i)。櫻桃番茄黃色花藥頂頸不育，通過花絲著生花基部、側(cè)連成花藥錐，腹縫開裂散粉(圖1:g，k)。毛酸漿和櫻桃番茄花柱淺綠色(圖1:c，h)，前者短于后者(表1)。

圖1 毛酸漿(P.pubescens)與櫻桃番茄(S.lycopersicum var.cerasiforme No.22.)花器形態(tài)與發(fā)育 A.毛酸漿花；B.毛酸漿花瓣和雄蕊；C.毛酸漿雌蕊和花萼；D.櫻桃番茄花萼；E.櫻桃番茄花；F.櫻桃番茄花瓣；G.櫻桃番茄雄蕊；H.櫻桃番茄雌蕊；I.毛酸漿花發(fā)育(-11～0 dpa)；J.毛酸漿果實(7 dpa)；K.櫻桃番茄花發(fā)育(-11～0 dpa)；L.櫻桃番茄果實(7 dpa)Fig.1 Morphologicalcharacteristics and development of the flower in P.pubescens and S.lycopersicum var.cerasiforme No.22 A.Flowerof P.pubescens; B.Petals and stamens of P.pubescens; C.Sepals and pistils of P.pubescens; D.Sepal of S.lycopersicum var.cerasiforme; E.Flower of S.lycopersicum var.cerasiforme; F.Petal of S.lycopersicum var.cerasiforme; G.Stamen of S.lycopersicum var.cerasiforme; H.Pistil of S.lycopersicum var.cerasiforme; I.Development of buds of P.pubescens(-11-0 dpa); J.Fruitof P.pubescens(7 dpa); K.Development of buds of S.lycopersicum var.cerasiforme(-11-0 dpa); L.Fruitof S.lycopersicum var.cerasiforme(7 dpa)

種Species花萼長Sepal length花萼寬Sepal width花藥長Anther length花絲長Filament length花柱長Style length毛酸漿P.pubescens5.20±0.502.10±0.102.13±0.183.05±0.514.09±0.15櫻桃番茄S.lycopersicum var.cerasiforme8.60±1.301.40±0.105.94±0.220.94±0.195.50±0.22

表2 小孢子發(fā)育關(guān)鍵特征期

毛酸漿花瓣紫色斑紋、紫花藥背裂散粉與茄屬(Solanum)番茄族(Lycopersicumsection)乳白花藥、頂頸可育和頂端散粉的類番茄茄(S.lycopersicoides)，黃花藥、頂頸可育、腹縫開裂散粉的潘那利番茄(S.pennellii)及花藥黃色、頂頸不育、腹縫開裂散粉的秘魯番茄(S.peruvianum)和栽培番茄(S.lycopersicum)的花器特征明顯不同。

2.2 小孢子發(fā)育

第一階段，U形造孢期(-11 dpa)。毛酸漿花蕾長1 mm，萼片緊閉(圖1:i)。花藥表皮層、藥室內(nèi)壁、中層和橫切絨氈層清晰可見；橫切“蝶形”花藥由藥隔和連結(jié)組織分成4個藥室，原表皮下的基本分生組織分化形成單層“U”形孢原細(xì)胞(archesporial cell)(圖2:a)。而櫻桃番茄花蕾1.25 mm；花粉囊的藥室和造孢細(xì)胞初顯(圖3:a)。

第二階段，造孢細(xì)胞平周分裂期(-10 dpa)?；ɡ?淡黃色)長1.5 mm，緊閉(圖1:i)。單層造孢細(xì)胞經(jīng)過平周分裂成雙層(圖2:b)。櫻桃番茄花蕾長1.5 mm、緊閉(圖1:k)；藥室內(nèi)壁細(xì)胞平周分裂成多層；花粉囊腔室造孢細(xì)胞平周分裂至2～3層，細(xì)胞體積變大形成清晰內(nèi)凹“C”形造孢細(xì)胞群(圖3:b)。

第三階段，小孢子母細(xì)胞形成期(-9 dpa)。毛酸漿花蕾長2.31 mm、緊閉(圖1:i)。造孢細(xì)胞經(jīng)平周和垂周分裂、體積增大，形成有棱角小孢子母細(xì)胞；藥室內(nèi)壁細(xì)胞平周分裂成雙層(圖2:c)。同期的櫻桃番茄綠色花蕾長3.88 mm、微張(圖1:k)；造孢細(xì)胞進(jìn)入“四分體”時期，經(jīng)多次平周分裂藥室內(nèi)壁細(xì)胞分化成多層；中層細(xì)胞和絨氈層也清晰可見(圖3:c)。

第四階段，四分體時期(-8 dpa)?；ɡ匍L度與-9 dpa(2.31 mm)相近，而徑向生長明顯，花蕾(黃色)仍處于閉合狀態(tài)。小孢子母細(xì)胞進(jìn)入“四分體”時期，并開始與絨氈層產(chǎn)生離層(圖2:d)。而櫻桃番茄綠色花蕾開口逐漸變大，長4.25 mm(圖1:k)；“四分體”發(fā)育成單獨的小孢子，絨氈層變薄或并開始解體，藥室腔增大(圖3:d)。

第五階段，單核小孢子早期(-7～-6 dpa)。黃色花蕾長至2.46 mm，仍處于閉合狀態(tài)(圖1:i)?！八姆煮w”發(fā)育成不規(guī)則/帶棱角小孢子，不過小孢子外壁因造孢素沉積和內(nèi)容物較少仍僅被甲苯胺藍(lán)染成淺藍(lán)；中層細(xì)胞為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)而被吸收并逐漸消失，藥室藥隔組織僅存2～3層內(nèi)壁細(xì)胞(圖2:e～f)。櫻桃番茄綠色花蕾長5.38 mm、微開花瓣初顯(圖1:k)；而花粉囊藥隔組織發(fā)育迅速，沿藥室藥隔組織內(nèi)凸明顯不同于毛酸漿(圖3:e～f)。

第六階段，單核小孢子中期(-5 dpa)。閉合的淡黃花蕾長4.15 mm(圖1:i)。小孢子體積逐漸變大，形狀不規(guī)則；絨氈層解體僅存少許殘片(圖2:g)。而此時的櫻桃番茄，花蕾長6.38 mm，花瓣從萼片伸出約0.5 mm(圖1:k)。小孢子變圓，絨氈層嚴(yán)重解體僅存殘片；藥隔組織向藥室內(nèi)凸更加明顯(圖3:g)。

第七階段，小孢子發(fā)育晚期(-4 dpa)。萼片變綠，“鐘形”花蕾長4.77 mm，微張，隱約可見淡黃花瓣(圖1:i)。小孢子體積逐漸變大，顏加深(圖2:h)。櫻桃番茄“柱形”綠色花蕾長7.13 mm，頂端微張，白色花瓣從萼片伸出1.63 mm(圖1:k)；小孢子變圓并被甲苯胺藍(lán)染成深色；藥隔組織繼續(xù)向藥室內(nèi)突(圖3:h)。

第八階段，花粉形成初期(-3 dpa)?；ɡ倏v向生長緩慢，徑向生長迅速，萼片打開，黃色花瓣清晰可見(圖1:i)。球形小孢子因孢粉素沉積和內(nèi)容物增加而被染成深藍(lán)色；中空的隔膜組織接近崩潰(圖2:i)。而櫻桃番茄花蕾長8 mm，花瓣從萼片伸出2 mm(圖1:k)；小孢子發(fā)育成近圓形多面體，隔膜組織也開始降解；藥隔組織繼續(xù)向藥室內(nèi)凸(圖3:i)。

第九階段，花粉成熟早期(-2 dpa)?；ɡ匍L6.62 mm，花萼停止生長，黃色花瓣從花萼伸出2.0 mm(圖1:i)。球形花粉成熟，隔膜組織消失，藥室變二為一(圖2:j)。櫻桃番茄花蕾長6.9 mm，花瓣伸出5.3 mm，此時花蕾仍保持閉合(圖1:k)。球形花粉大小不一，接近成熟，隔膜降解也使藥室變二為一；藥隔組織仍快速向藥室內(nèi)凸(圖3:j)。

第十階段，花粉成熟期(-1 dpa)。大花蕾長7.23 mm，花瓣伸出花萼3.1 mm并疊抱，花蕾仍處于閉合狀態(tài)(圖1:i)?；ǚ鄢墒?，花藥裂口區(qū)域僅存1層細(xì)胞(圖2:k)。櫻桃番茄花蕾長8.0 mm，黃色花瓣微張伸出花萼6.1 mm(圖1:k)?；ǚ鄢墒?，裂口區(qū)僅存1層細(xì)胞，藥隔組織繼續(xù)向藥室內(nèi)凸(圖3:k)。

第十一階段，散粉期(0 dpa)。淡黃瓣展開(圖1:a～d)。藥囊背縫開裂，花粉散出(圖2:l)。櫻桃番茄黃色花瓣展開，祼露出黃色花藥，進(jìn)入開花期(圖1:k)。花藥腹縫開裂，成熟花粉散出，藥隔組織繼續(xù)發(fā)育并伸至藥室中部，約占藥室空間的1/2(圖3:l)。

圖2 毛酸漿小孢子發(fā)育(-11～0 dpa) a～l.毛酸漿小孢子在-11～0 dpa期的發(fā)育 C.藥隔組織；E.表皮層；En.藥室內(nèi)壁；ML.中層；MMC.小孢子母細(xì)胞；MSp.小孢子細(xì)胞；PG.花粉粒；Sm.隔膜組織；Sp.造孢細(xì)胞；StR.裂口區(qū)域；T.絨氈層；Tds.四分體；V.維管束組織；Va.液泡Fig.2 The microspore development in P.pubescens during -11-0 dpa a-l. Indicatemicrospore developmentstages during -11-0 dpa C. Connective tissue; E. Epidermis; En. Endothecium; ML. Middle layer; MMC. Microspore mother cells; MSp. Microspores; PG. Pollen grains; Sm. Septum; Sp. Sporogenous cells; St. Stomium; StR. Stomium region; T. Tapetum; Tds. Tetrads; V. Vascular bundle; Va. Vacuoles

圖3 櫻桃番茄小孢子發(fā)育(-11～0 dpa) a～l.小孢子不同發(fā)育期(-11～0 dpa) C.藥隔組織；E.表皮層；En.藥室內(nèi)壁；ML.中層；MMC.小孢子母細(xì)胞；MSp.小孢子細(xì)胞；PG.花粉粒；Sm.隔膜組織；Sp.造孢細(xì)胞；StR.裂口區(qū)域；T.絨氈層；Tds.四分體；V.維管束組織；Va.液泡Fig.3 The microspore development in S.lycopersicum var.cerasiforme No.22 during -11-0 dpa a-l. Indicatemicrospore development stages during -11-0 dpa C. Connective tissue; E. Epidermis; En. Endothecium; ML. Middle layer; MMC. Microspore mother cells; MSp. Microspores; PG. Pollen grains; Sm. Septum; Sp. Sporogenous cells; St. Stomium; StR. Stomium region; T. Tapetum; Tds. Tetrads; V. Vascular bundle; Va. Vacuoles

3 討論

毛酸漿(P.pubescens)和櫻桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)均為茄科黃色漿果類植物，二者花器形態(tài)存在明顯差異。開花(0 dpa)前，毛酸漿花萼生長緩慢，開花后未開裂基部生長迅速并形成“燈籠罩”包被果實(圖1:i～j)。櫻桃番茄5枚花萼基部不聚合，在開花前、后生長速度沒有明顯改變，無花萼包被果實的現(xiàn)象(圖1:k～l)。毛酸漿淡黃花瓣紫色斑紋、淡紫花藥在花瓣基部著生、頂頸可育、不側(cè)連和背部開裂散粉方式與櫻桃番茄明顯不同，后者黃色花瓣和花藥、花藥“頂頸不育”、側(cè)連成花藥錐、腹縫開裂散粉(圖1:k～l)。盡管二者均起源于南美大陸，這些花器形態(tài)差異可能與其適應(yīng)南美的復(fù)雜生態(tài)環(huán)境、傳粉昆蟲對花色偏愛的協(xié)同進(jìn)化有關(guān)[15]。

毛酸漿(P.pubescens)和櫻桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)小孢子發(fā)育進(jìn)程也不盡相同。至“四分體”時期，毛酸漿發(fā)育比櫻桃番茄遲(圖2:a～d，圖3:a～d)；而從“四分體”后至花粉成熟卻表現(xiàn)出毛酸漿小孢子發(fā)育快于櫻桃番茄趨勢(圖2:e～l，圖3:e～l，表2)。同時，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，櫻桃番茄在小孢子發(fā)育初期藥隔組織開始向藥室內(nèi)凸，至花粉成熟期約占據(jù)藥室空間的1/2，而毛酸漿中卻無該生物學(xué)特征(圖2:e～l，圖3:e～l)，這可能與物種間進(jìn)化差異有關(guān)，而該結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能還有待研究。

茄科(Solanaceae)是80余個屬近3000個種的植物大家族，物種間遺傳多樣性極其豐富。用比較生物學(xué)方法研究毛酸漿(P.pubescens)和櫻桃番茄花器植物學(xué)特征和小孢子發(fā)育，對理解茄科植物物種形成、花發(fā)育、繁衍和產(chǎn)量形成具有重要的科學(xué)意義。