• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    玫瑰茄轉(zhuǎn)錄組測序及花青素合成相關基因表達分析

    2020-05-21 03:33練冬梅賴正鋒姚運法
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年6期
    關鍵詞:轉(zhuǎn)錄組花萼花青素

    練冬梅 賴正鋒 姚運法

    摘要:以玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa Linnaeus)花瓣和花萼為研究對象,采用Illumina HiseqTM 2500高通量測序技術,對花瓣和花萼進行轉(zhuǎn)錄組測序及花青素合成相關基因差異表達分析。結果表明,花瓣和花萼共獲得13.94 Gb有效數(shù)據(jù)(clean data),Q30堿基百分比均達到93.0%以上;共獲得1 399個差異表達基因(DEGs),包括65個上調(diào)基因,1 334個下調(diào)基因,且功能注釋的基因有1 176個;篩選出了與花青素合成相關結構基因CHI、FLS、ANR、CHI在花萼中表達顯著,F(xiàn)LS、ANR在花瓣中表達顯著。本研究豐富了花青素相關研究,可為闡明玫瑰茄花青素合成機制提供理論依據(jù)。

    關鍵詞:玫瑰茄;花瓣;花萼;轉(zhuǎn)錄組;花青素;差異表達基因

    中圖分類號: Q786;S681.901? 文獻標志碼: A? 文章編號:1002-1302(2020)06-0041-05

    玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa L.)為錦葵科木槿屬一年生草本植物,別稱洛神花(roselle、gongura)、芙蓉茄、山茄子、紅果梅、蘇丹茶、美麗納等。原產(chǎn)西非至南亞,廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū),玫瑰茄在臺灣、廣西、廣東、福建和云南等南部地區(qū)均有栽培。玫瑰茄2004年被衛(wèi)生部和衛(wèi)計委列入新食品原料名單[1],是一種藥食兩用的植物。玫瑰茄花重要部位花瓣(亮黃色)和花萼(紫紅色)具有藥用功能,均是具有重要開發(fā)價值的器官,富含花青素、黃酮、多酚酸、有機酸等營養(yǎng)成分,花瓣部位主要用于開發(fā)花茶,而花萼部位利用率最高,已廣泛用于制作玫瑰茄醬[2]、飲料[3]、酸奶[4]、果酒[5]等,在食品工業(yè)中被用作著色、調(diào)味添加劑;花萼具有利尿、抗氧化、抗癌、降血壓、降血脂和降血糖等保健功能[6-9],在玫瑰茄保健品開發(fā)方面具有巨大潛力。當前,國內(nèi)對玫瑰茄研究主要集中在栽培技術、化學成分及功效分析、玫瑰茄花青素及玫瑰茄產(chǎn)品加工技術上,但其理論基礎研究還很薄弱,例如玫瑰茄花青素合成相關代謝途徑的研究尚屬空白。

    花青素是構成植物顏色的主要水溶性色素之一,屬于類黃酮,主要以糖苷的形式存在于植物液泡中[10],迄今從自然界分離和鑒定出的花青素苷多達600種,主要從矢車菊素苷元(cyanidin)、飛燕草素苷元(delphinidin)、天竺葵素苷元(pelargonidin)、芍藥花素苷元(peonidin)、矮牽牛素苷元(petunidin)、錦葵素苷元(malvidin)等6種花青素苷元衍生而來[11]。花青素苷合成始于苯丙氨酸,途經(jīng)多步酶促反應,主要由上游基因(CHS、CHI、F3H、F3′H和F3′5′H等)和下游基因(DFR、ANS、GT、AT和MT等)參與表達。研究表明,植物花青素兼具營養(yǎng)、藥理以及基因工程中改良花色等作用[12-14]。近年來,已有許多生物通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術完成了全轉(zhuǎn)錄功能基因組測序[15-16]。關于花青素合成相關基因在其他植物中也有相關研究[17-18]。玫瑰茄分子遺傳學與功能基因組學研究較落后,眾多玫瑰茄農(nóng)藝性狀的分子調(diào)控機制仍不清楚,關聯(lián)轉(zhuǎn)錄組學是一種鑒定調(diào)控目標性狀候選基因的新方法。本研究利用Illumina HiseqTM 2500高通量測序技術對玫瑰茄花瓣、花萼進行轉(zhuǎn)錄組測序,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其花青素合成代謝途徑相關基因分析,探討玫瑰茄花瓣、花萼花青素合成機制和相關差異表達基因,以期為后續(xù)玫瑰茄相關研究提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    玫瑰茄為福建省漳州市漳浦縣種植品種,種植地點位于福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗農(nóng)場,2017年6月15日種植,8月25日開始采集樣品。采集標準:分別采集同一株玫瑰茄的花蕾(開花前一天09:00采集)10朵,共3株,將花蕾的花瓣和花萼分離后進行混合,立即用液氮速凍,置于-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試驗方法

    1.2.1 高通量測序及數(shù)據(jù)組裝 采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒提取玫瑰茄花瓣、花萼的總RNA。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100技術檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性,構建cDNA文庫,再使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量,以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后,用Illumina HiseqTM 2500進行高通量測序,獲得原始數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)過濾后去除其中的接頭序列及低質(zhì)量讀序(reads),獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)(clean data),用Trinity軟件對clean data進行組裝,組裝成為轉(zhuǎn)錄本序列(transcripts),將不同樣品組裝結果中多個可變剪接的transcripts聚類到一個基因,得到單基因序列(unigene)庫。

    1.2.2 差異基因的功能注釋 使用BLAST軟件將Unigene與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、NOG、KEGG、Pfam等8個數(shù)據(jù)庫進行比對(E值≤10-5),獲得Unigene的注釋信息。

    1.2.3 花青素合成相關差異基因分析 利用上述數(shù)據(jù)庫對玫瑰茄花瓣、花萼花青素合成進行檢索,分析花青素合成相關基因在KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋及代謝路徑。按照FPKM(每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段)法計算差異基因的表達量,如果倍數(shù)變化(log2 Fold change)>0,認為是上調(diào)表達,反之,便認為是下調(diào)表達。

    2 結果與分析

    2.1 數(shù)據(jù)組裝及分析

    玫瑰茄花瓣和花萼經(jīng)高通量測序和質(zhì)量控制,共獲得13.94 Gb clean data,其中花瓣clean data為7.29 Gb,花萼clean data為6.65 Gb,其Q30堿基百分比均達到93.0%以上,表明測序結果可靠,可用于后續(xù)的分析。對組裝結果進行統(tǒng)計(表1),總共產(chǎn)生72 029條單基因序列和148 309條轉(zhuǎn)錄本序列,N50(對一條染色體進行測序,將測序得到的reads進行拼接,當拼接的序列長度達到染色體長度的一半時,叫做N50長度)分別為1 010、1 274 bp,組裝完整性較高;其中長度區(qū)間位于 200~300 bp的Unigene數(shù)量最多,為24 697條,占34.29%。

    2.2 Unigene功能注釋

    為獲得Unigene的功能注釋信息,通過NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、NOG、GO、Pfam等8個數(shù)據(jù)庫進行注釋分析(表2),在72 029條Unigene中,共獲得44 887條(62.32%)Unigene的注釋。以上8個數(shù)據(jù)庫比對分析中,分別獲得44 274(61.47%)、27 510(38.19%)、15 908(22.09%)、10 438(14.49%)、23 790(33.03%)、40 386(56.07%)、20 981(29.04%)、25 191條(34.97%)Unigene功能注釋。

    2.3 差異表達基因(DEGs)分析

    通過對玫瑰茄花瓣和花萼差異基因的表達分析,共獲得1 399個DEGs,包括65個上調(diào)基因,1 334 個下調(diào)基因;將DEGs單基因序列分別注釋到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、NOG、NR等8個數(shù)據(jù)庫中,共獲得1 176條基因功能注釋,其中COG數(shù)據(jù)庫267條,GO數(shù)據(jù)庫526條,KEGG數(shù)據(jù)庫285條,KOG數(shù)據(jù)庫562條,Pfam數(shù)據(jù)庫853條,Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫773條,NOG數(shù)據(jù)庫1 066條,NR數(shù)據(jù)庫1 165條,其中NR數(shù)據(jù)庫注釋比最高,達99.06%。

    2.3.1 GO功能注釋 對玫瑰茄花瓣和花萼的DEGs進行GO功能注釋,共分為三大類,分別為生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)。GO分類統(tǒng)計顯示,526條DEGs被歸到40個功能小類(表3)。生物學過程中DEGs在單一生物過程、細胞過程和代謝過程3個功能小類中分布數(shù)量最多;細胞組分中DEGs在細胞、細胞成分和膜結構3個功能小類中分布數(shù)量最多;分子功能中DEGs在催化活性和結合活性2個功能小類中分布數(shù)量最多。

    2.3.2 COG功能注釋 在玫瑰茄花瓣和花萼的轉(zhuǎn)錄本中,將注釋到COG數(shù)據(jù)庫的267條DEGs進行直系同源分類,并獲得21個功能分類(圖1),差異基因注釋主要集中在R(一般性功能預測)、T(信號轉(zhuǎn)導機制)、K(轉(zhuǎn)錄)和L(復制、重組和修復)中。

    2.3.3 KEGG功能注釋 將DEGs通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對(表4),有283個DEGs得到注釋,分別富集在64條代謝通路,其中涉及較多的是淀粉和蔗糖代謝(38個)、戊糖和葡萄糖醛酸互相轉(zhuǎn)化(35個)、植物病原體相互作用(24個)、甘油磷脂代謝(11個)、胞吞作用(11個)和苯丙素生物合成(10個)等。本研究著重選擇與花青素合成密切相關的代謝通路[類黃酮生物合成(5個)],并找到與花青素代謝相關的差異基因。

    2.4 花青素合成相關基因差異性分析

    通過對玫瑰茄花瓣和花萼轉(zhuǎn)錄組測序結果進行功能注釋、功能分類及代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)(表5),花青素合成途徑中,查爾酮-黃烷酮異構酶(chalcone isomaerase,CHI)基因在玫瑰茄花萼中具有顯著表達優(yōu)勢,上調(diào)表達4.9倍,黃酮醇合成酶(flavonol synthase,F(xiàn)LS)、花青素還原酶(anthocyanidin reductase,ANR)基因則在玫瑰茄花瓣中具有顯著表達優(yōu)勢。這些差異表達基因參與著玫瑰茄花瓣和和花萼的花青素合成代謝途徑,影響著玫瑰茄花青素的合成。

    3 討論

    本研究通過Illumina HiSeqTM 2500高通量測序技術構建玫瑰茄花瓣和花萼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,比較分析花瓣和花萼數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)花青素合成相關代謝途徑中差異表達的基因。

    玫瑰茄花瓣、花萼中花青素代謝表現(xiàn):p-香豆酰-輔酶A(p-coumaroyl-CoA)和3分子丙二 醛- 輔酶A (3×Malnoyl-CoA), 在查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)催化下,生成查爾酮(chalcone),查爾酮又在CHI作用下形成柚皮素(naringenin,NAR),此過程花萼中CHI基因表達比花瓣顯著,將大量查爾酮轉(zhuǎn)化成花青素合成代謝所必需的NAR;玫瑰茄花瓣、花萼中NAR在黃烷 酮-3-羥基化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F(xiàn)3H)催化下產(chǎn)生二氫山奈酚(dihydokaempferol,DHK),DHK分別在類黃 酮-3′-羥基化酶(flavonoid-3′-hydroxylase,F(xiàn)3′H)和類黃酮-3′5′-羥基化酶(flavonoid-3′5′-hydroxylase,F(xiàn)3′5′H)作用下生成二氫槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)和二氫楊梅素(dihydromyricetin,DHM),DHK、DHQ和DHM在二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)作用下分別生成無色天竺葵苷元(leucopelargonidin)、無色矢車菊苷元(leucocyanidin)和無色飛燕草素苷元(leucodelphinidin),而后分別在花青素苷合成酶(anthocyanin synthase,ANS)作用下生成有色的天竺葵苷元(pelargonidin)、矢車菊苷元(cyanidin)和飛燕草素苷元(delphinidin),各種花青素苷元分別在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases,GT)等作用下,生成穩(wěn)定的花青素苷。此過程中玫瑰茄花瓣中FLS和ANR基因顯著表達,進入黃酮醇代謝途徑和原花青素代謝途徑,說明FLS、ANR可能通過底物競爭方式影響花青素合成,而玫瑰茄花萼CHI上調(diào)表達,F(xiàn)LS和ANR下調(diào)表達,有利于花青素合成。本研究豐富了花青素相關研究,可為闡明玫瑰茄花青素合成機制提供理論依據(jù)。

    參考文獻:

    [1]佚名. 衛(wèi)計委: 有關新食品原料,普通食品名單匯總[J]. 飲料工業(yè),2014,17(8):58-62.

    [2]Adeleke T O,Ashsye O A. Quality attributes of stored Roselle jam[J]. Int Food Res,2009,16(3):363-371.

    [3]耿 華. 關于玫瑰茄飲料的試驗與研究[J]. 軟飲料工業(yè),1996(1):21-24.

    [4]Iwalokun A B,Shittu M O. Effect of Hibiscus sabdariffa(Calyce)extract on biochemical and organoleptic properties of yogurt[J]. Pakistan Journal of Nutrition,2007,6(2):172-182.

    [5]孫軍濤,肖付剛,祝鑫冉. 玫瑰茄蘋果果酒的研制[J]. 釀酒科技,2015(2):78-80.

    [6]Hirunpanich V,Utaipat A,Morales N P,et al. Antioxidant effects of aqueous extracts from dried calyx of Hibiscus sabdariffa Linn. (Roselle) in vitro using rat low-density lipoprotein (LDL)[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin,2005,28(3):481-484.

    [7]Akim A,Ling L C,Rahmat A,et al. Antioxidant and anti-proliferative activities of Roselle juice on Caov-3,MCF-7,MDA-MB-231 and HeLa cancer cell lines[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2011,5(7):957-965.

    [8]Ubani C S,Joshua P E,Oraeki A N. Influence of aqeous extract of Hibiscus sabdariffa calyces on lipid profile of phenobarbitone induces wistar albinorats[J]. Journal of Pharmacy Research,2010(2):319-324.

    [9]Gosain S,Ircchiaya R,Sharma P C,et al. Hypolipidemic effect of ethanolic extract from the leaves of Hibiscus sabdariffa L. in hyperlipidemic rats[J]. Acta Poloniae Pharmaceutica,2010,67(2):179-184.

    [10]Fleschhut J,Kratzer F,Rechkemmer G,et al. Stability and biotransformation of various dietary anthocyanins in vitro[J]. European Journal of Nutrition,2006,45(1):7-18.

    [11]Kong J M,Chia L S,Goh N K,et al. Analysis and biological activities of anthocyanins[J]. Phytochemistry,2003,64(5):923-933.

    [12]Dos Passos A D,Madrona G S,Marcolino V A,et al. The use of thermal analysis and photoacoustic spectroscopy in the evaluation of maltodextrin microencapsulation of anthocyanins from juara palm fruit(Euterpe edulis Mart.)and their application in food[J]. Food Technol Biotechnol,2015,53(4):385-396.

    [13]Lippert E,Ruemmele P,Obermeier F,et al. Anthocyanins prevent colorectal cancer development in a mouse model[J]. Digestion,2017,95(4):275-280.

    [14]Fernandes I,Marques C,Evora A,et al. Pharmacokinetics of table and Port red wine anthocyanins:a crossover trial in healthy men[J]. Food & Function,2017,8(5):2030-2037.

    [15]Sheng L X,Xia W,Zang S,et al. Transcriptome-sequencing analyses reveal putative genes related to flower color variation in Chinese Rosa rugosa[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2018,40(3):62-75.

    [16]Wang J W,Guo M L,Li Y H,et al. High-throughput transcriptome sequencing reveals the role of anthocyanin metabolism in Begonia semperflorens under high light stress[J]. Photochemistry and Photobiology,2018,94(1):105-114.

    [17]孟亞南,張 琳,劉召強,等. 荷花轉(zhuǎn)錄組測序及花青素苷合成相關基因表達分析[J]. 西南林業(yè)大學學報(自然科學版),2018,38(2):61-69.

    [18]蔣會兵,孫云南,李 梅,等. 紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期花青素積累及合成相關基因的表達[J]. 茶葉科學,2018,38(2):174-182.張建棟,黃 萌,宋云生,等. 不同栽培措施對雙低油菜蘇油8號產(chǎn)量與品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2020,48(6):46-49.

    猜你喜歡
    轉(zhuǎn)錄組花萼花青素
    兄弟相親似“花萼”
    原花青素B2通過Akt/FoxO4通路拮抗內(nèi)皮細胞衰老的實驗研究
    花青素對非小細胞肺癌組織細胞GST-π表達的影響
    山楸梅漿果中花青素提取方法的優(yōu)化和測定
    原花青素對腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護作用
    不同處理的紫藤花萼中黃色素提取及理化性質(zhì)研究
    一个人看视频在线观看www免费 | 国产精品永久免费网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美另类亚洲清纯唯美| 1024手机看黄色片| 在线永久观看黄色视频| 久久久久久九九精品二区国产| 精品国产亚洲在线| 999精品在线视频| 色综合婷婷激情| 日本一本二区三区精品| 久久久色成人| 天堂√8在线中文| 亚洲欧美激情综合另类| 成人三级黄色视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人aa在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产真人三级小视频在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产一区二区三区视频了| 亚洲午夜理论影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜视频精品福利| 国产麻豆成人av免费视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品久久久久久精品电影| 999久久久国产精品视频| 色老头精品视频在线观看| www日本在线高清视频| 久久精品91蜜桃| 免费看a级黄色片| 一进一出好大好爽视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产乱人视频| 白带黄色成豆腐渣| 99久国产av精品| 久久久久久国产a免费观看| 男女午夜视频在线观看| 我的老师免费观看完整版| 黄色日韩在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产v大片淫在线免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品亚洲美女久久久| 国产成人av激情在线播放| 国产97色在线日韩免费| 一级毛片女人18水好多| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久久久久久免费视频了| 男插女下体视频免费在线播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲黑人精品在线| av在线天堂中文字幕| 男女之事视频高清在线观看| 欧美黑人巨大hd| 麻豆国产av国片精品| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美日韩黄片免| 曰老女人黄片| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲中文字幕日韩| 嫩草影视91久久| 国产男靠女视频免费网站| 欧美在线黄色| 亚洲激情在线av| 亚洲熟妇熟女久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品av久久久久免费| 偷拍熟女少妇极品色| 中文字幕熟女人妻在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美一区二区精品小视频在线| 此物有八面人人有两片| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久精品人妻少妇| 欧美日韩综合久久久久久 | 成年人黄色毛片网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 久99久视频精品免费| xxxwww97欧美| 国产高清videossex| 怎么达到女性高潮| 窝窝影院91人妻| aaaaa片日本免费| 久久久国产成人免费| 精品一区二区三区四区五区乱码| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久国产a免费观看| 美女大奶头视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av片天天在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成年版毛片免费区| 曰老女人黄片| 99视频精品全部免费 在线 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99精品久久久久人妻精品| 久久九九热精品免费| 午夜免费激情av| 一本久久中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜两性在线视频| 亚洲片人在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 啦啦啦韩国在线观看视频| 全区人妻精品视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 禁无遮挡网站| 国内精品久久久久精免费| 国产高清视频在线播放一区| 免费大片18禁| 在线播放国产精品三级| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲欧美日韩东京热| 日本与韩国留学比较| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 色尼玛亚洲综合影院| 国产毛片a区久久久久| 国产一区二区在线观看日韩 | 嫁个100分男人电影在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 国内精品美女久久久久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲无线在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 91在线观看av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美黄色片欧美黄色片| 我要搜黄色片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美色欧美亚洲另类二区| 在线播放国产精品三级| 一级毛片精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产高清视频在线播放一区| 在线永久观看黄色视频| 天天添夜夜摸| 国产成人影院久久av| 午夜福利在线观看吧| 日本免费a在线| 九色成人免费人妻av| 久久久国产欧美日韩av| 在线观看66精品国产| 天堂影院成人在线观看| 成人三级做爰电影| 在线免费观看不下载黄p国产 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | av福利片在线观看| 美女大奶头视频| 十八禁网站免费在线| 偷拍熟女少妇极品色| 俺也久久电影网| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 三级国产精品欧美在线观看 | 色视频www国产| 日本一本二区三区精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一边摸一边抽搐一进一小说| 美女被艹到高潮喷水动态| 免费看a级黄色片| 亚洲av熟女| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人亚洲精品av一区二区| 中文字幕高清在线视频| 天堂网av新在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲av美国av| 嫩草影院精品99| 香蕉国产在线看| 久久伊人香网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 一个人免费在线观看的高清视频| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人aa在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩精品中文字幕看吧| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久久久精品吃奶| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲在线自拍视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 色视频www国产| 久久午夜综合久久蜜桃| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产三级中文精品| 天堂动漫精品| 桃红色精品国产亚洲av| 国产成人av激情在线播放| av天堂在线播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成人欧美大片| av国产免费在线观看| 香蕉国产在线看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲av成人av| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产高清在线一区二区三| 午夜福利免费观看在线| 午夜福利高清视频| 性色avwww在线观看| 丁香六月欧美| 丰满的人妻完整版| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美三级亚洲精品| 51午夜福利影视在线观看| 一本精品99久久精品77| 美女午夜性视频免费| 美女cb高潮喷水在线观看 | 天天躁日日操中文字幕| 中文资源天堂在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产单亲对白刺激| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本a在线网址| xxx96com| 一a级毛片在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产午夜精品论理片| 国产91精品成人一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 搡老妇女老女人老熟妇| 午夜日韩欧美国产| 国产高清视频在线观看网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 18禁美女被吸乳视频| 国产精品一区二区免费欧美| 午夜影院日韩av| 色播亚洲综合网| 国产激情久久老熟女| 国产免费男女视频| 久久久国产欧美日韩av| 色综合欧美亚洲国产小说| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲国产精品999在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久色成人| 可以在线观看毛片的网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产三级黄色录像| 99精品久久久久人妻精品| 中文字幕高清在线视频| 五月玫瑰六月丁香| av黄色大香蕉| 美女大奶头视频| 成人av在线播放网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 伦理电影免费视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 后天国语完整版免费观看| 国产精品亚洲美女久久久| www日本黄色视频网| 亚洲av第一区精品v没综合| 女人被狂操c到高潮| 少妇的逼水好多| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品色激情综合| 免费观看的影片在线观看| 怎么达到女性高潮| 此物有八面人人有两片| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成人欧美在线观看| 麻豆成人av在线观看| 亚洲九九香蕉| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 美女大奶头视频| 一进一出抽搐动态| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 俺也久久电影网| 一本综合久久免费| 一进一出好大好爽视频| 亚洲成人久久爱视频| 人人妻人人看人人澡| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产高清激情床上av| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久国产一级毛片高清牌| 天天一区二区日本电影三级| 欧美在线黄色| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩欧美在线二视频| 国产亚洲av高清不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日本 欧美在线| 久久精品影院6| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产在线精品亚洲第一网站| 我的老师免费观看完整版| 免费av毛片视频| 麻豆国产av国片精品| 少妇的逼水好多| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国产乱码久久久久久男人| 美女午夜性视频免费| 黄频高清免费视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产免费男女视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产欧美日韩一区二区精品| 怎么达到女性高潮| 国产三级中文精品| 一夜夜www| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美日韩乱码在线| 一进一出抽搐动态| 国产探花在线观看一区二区| 日韩国内少妇激情av| 99国产精品一区二区三区| av福利片在线观看| 日本黄大片高清| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产欧美人成| www.www免费av| 色视频www国产| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲欧美日韩东京热| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产成人影院久久av| 真人做人爱边吃奶动态| 国产免费av片在线观看野外av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲国产欧美网| 国产一区二区在线观看日韩 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 极品教师在线免费播放| 香蕉国产在线看| 国产精品日韩av在线免费观看| 51午夜福利影视在线观看| 精品久久蜜臀av无| 亚洲欧美日韩东京热| 国产主播在线观看一区二区| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲在线观看片| 搡老岳熟女国产| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 三级毛片av免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 身体一侧抽搐| 日韩欧美免费精品| 久久人妻av系列| 日韩欧美 国产精品| 亚洲国产精品成人综合色| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩欧美精品v在线| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产乱人视频| 国产99白浆流出| 午夜a级毛片| 69av精品久久久久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩 | xxx96com| 欧美极品一区二区三区四区| 韩国av一区二区三区四区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日本 欧美在线| 亚洲国产欧美网| 国产91精品成人一区二区三区| 久久九九热精品免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 美女cb高潮喷水在线观看 | 精品乱码久久久久久99久播| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 黄色 视频免费看| 亚洲,欧美精品.| 国产精品 国内视频| 99热这里只有精品一区 | 日韩大尺度精品在线看网址| 大型黄色视频在线免费观看| 岛国视频午夜一区免费看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费在线观看日本一区| 波多野结衣高清无吗| 国产成年人精品一区二区| 1024手机看黄色片| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日本一二三区视频观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 97碰自拍视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲精品一区二区www| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 法律面前人人平等表现在哪些方面| h日本视频在线播放| 香蕉av资源在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 日日夜夜操网爽| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久精品影院6| 两人在一起打扑克的视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| ponron亚洲| 欧美激情在线99| 国产精品99久久久久久久久| 午夜福利免费观看在线| 两个人看的免费小视频| 1000部很黄的大片| 美女cb高潮喷水在线观看 | 久久天堂一区二区三区四区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美性猛交黑人性爽| av黄色大香蕉| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美黄色淫秽网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 一夜夜www| 国产欧美日韩精品一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 美女高潮的动态| 91字幕亚洲| 国产高清视频在线播放一区| 成年免费大片在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费看日本二区| 日本三级黄在线观看| av中文乱码字幕在线| 后天国语完整版免费观看| 婷婷亚洲欧美| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久国产乱子伦精品免费另类| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲熟女毛片儿| 久久亚洲真实| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 国产乱人视频| 亚洲 国产 在线| 成人无遮挡网站| 免费一级毛片在线播放高清视频| www.999成人在线观看| 久久久国产成人精品二区| 国产亚洲av高清不卡| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 久久99热这里只有精品18| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日本熟妇午夜| 美女cb高潮喷水在线观看 | 深夜精品福利| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 99热6这里只有精品| 啦啦啦免费观看视频1| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美在线黄色| 性欧美人与动物交配| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲国产色片| 我的老师免费观看完整版| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产69精品久久久久777片 | www.999成人在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 色老头精品视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 久久这里只有精品19| 天天一区二区日本电影三级| 国产成人福利小说| 91老司机精品| 久久久久久久久久黄片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 丰满的人妻完整版| 午夜久久久久精精品| 他把我摸到了高潮在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| av在线天堂中文字幕| 日本三级黄在线观看| 我的老师免费观看完整版| 欧美在线一区亚洲| 国产精华一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 俄罗斯特黄特色一大片| 99久久99久久久精品蜜桃| 舔av片在线| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 两个人看的免费小视频| 男女下面进入的视频免费午夜| www国产在线视频色| 少妇人妻一区二区三区视频| www国产在线视频色| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久99久视频精品免费| 大型黄色视频在线免费观看| 操出白浆在线播放| 久久国产精品影院| 此物有八面人人有两片| 在线观看免费午夜福利视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩精品网址| 国产精品久久视频播放| 又紧又爽又黄一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 中国美女看黄片| av在线蜜桃| 国产单亲对白刺激| 一二三四社区在线视频社区8| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产97色在线日韩免费| 1024香蕉在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 成人无遮挡网站| 国产av在哪里看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 淫秽高清视频在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 在线看三级毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av | av天堂中文字幕网| 一级作爱视频免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 看片在线看免费视频| or卡值多少钱| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 99国产精品一区二区三区| 久久香蕉国产精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品一区二区三区四区久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人啪精品午夜网站| 美女黄网站色视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产一区二区激情短视频| 国产精品野战在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 一本综合久久免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 小说图片视频综合网站| 麻豆国产av国片精品| 午夜福利在线在线| 99久国产av精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲18禁久久av| 亚洲成av人片在线播放无| 91在线精品国自产拍蜜月 | 麻豆成人av在线观看| 日本黄色片子视频| 天堂√8在线中文| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲欧美激情综合另类| 国产成年人精品一区二区| 色老头精品视频在线观看| 无人区码免费观看不卡| 免费电影在线观看免费观看| 免费看光身美女| 久久久国产成人免费| 国产不卡一卡二| 一级毛片女人18水好多| 观看美女的网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲,欧美精品.| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产欧美日韩一区二区精品| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本 欧美在线| 国产野战对白在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费人成视频x8x8入口观看|