西北干旱區(qū)孑遺瀕危植物四合木(Tetraena mongolica)葉綠體基因組特征研究及比較分析

段義忠 杜忠毓 王海濤

(1.榆林學(xué)院陜西省陜北生態(tài)修復(fù)重點實驗室,榆林 719000； 2.寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)省部共建國家重點實驗室培育基地,銀川 750021； 3.寧夏大學(xué)西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點實驗室,銀川 750021)

葉綠體(cp)是綠色植物進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化和光合作用的主要場所，是質(zhì)體的一種形式，且其分化程度非常高。葉綠體存在于綠色植物的葉肉細(xì)胞中，其不僅具有參與光合作用，并且還是葉綠素、脂肪酸、氨基酸、淀粉等物質(zhì)的十分重要的合成場所[1～2]。自1986年首次獲得煙草(Nicotianatabacum)完整的葉綠體基因組信息以來[3]，已經(jīng)有數(shù)百例葉綠體植物的葉綠體基因組序列被陸續(xù)公布[4]。葉綠體基因組一般情況下為雙線環(huán)狀分子，也有線狀結(jié)構(gòu)，由兩個反向重復(fù)區(qū)序列(反向重復(fù)區(qū)A(IRa)和反向重復(fù)區(qū)B(IRb))及一個大單拷貝區(qū)(LSC)和一個小單拷貝區(qū)(SSC)構(gòu)成[5]。葉綠體基因順序和結(jié)構(gòu)具有高度保守的特性[6～7]，這使得其作為植物系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化研究的重要標(biāo)記，近年來，大量的葉綠體基因組序列被廣泛的研究[8]。

四合木(Tetraenamongolica)屬蒺藜科(Zygophyllaceae)的一個單種屬古地中海孑遺植物，我國特有和狹長分布種，國家二級珍稀瀕危植物，內(nèi)蒙古自治區(qū)唯一的特有屬植物，中國生物多樣性保護(hù)的優(yōu)先保護(hù)植物，在我國西鄂爾多斯高原有少量分布[9]。四合木起源古老、抗逆性較強(qiáng)，并且其為生物多樣性起源和環(huán)境演變研究的理想對象，因此四合木具有重要的學(xué)術(shù)價值[10～12]，然而，近年來，四合木分布區(qū)周圍沙漠的地理隔離及城市化和工業(yè)化帶來的土地濫用[13]，導(dǎo)致四合木的分布面積不斷縮小，種群數(shù)量快速下降并處于瀕危狀態(tài)[14]。其為單屬種植物，長期的生活中，其種間雜交較為方便，但是當(dāng)前研究人員對其基因的研究認(rèn)識較為缺乏。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，其可作為一種高效的方法，為我們研究物種微觀上的變化提供了諸多便利。第二代高通量測序技術(shù)是基于一種高通量的焦磷酸合成測序法，利用乳液聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，在一個皮升大小的流動池內(nèi)進(jìn)行測序。與第一代Sanger測序技術(shù)相比，第二代測序技術(shù)降低了測序成本，提高了測序速率，其具有結(jié)果較準(zhǔn)確、迅速、高效等特點。推動了綠色植物完整葉綠體基因組的發(fā)展，雖然目前己經(jīng)積累了大量的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，但在蒺藜科植物的葉綠體基因組數(shù)據(jù)還相對較為缺乏。

本研究通過對四合木葉綠體基因組進(jìn)行測序、組裝、注釋和比較，通過比較29種牻牛兒苗目和1種蒺藜目植物的葉綠體基因組，分析四合木葉綠體基因組的分布和結(jié)構(gòu)特點，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，為四合木葉綠體蛋白編碼基因變異及環(huán)境適應(yīng)性分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

四合木新鮮幼嫩葉片取于內(nèi)蒙古自治區(qū)烏海市四合木自然保護(hù)區(qū)(35°25′60″N，106°46′03″E)，海拔1 089 m，新鮮葉片保存于-80℃液氮冷藏樣品以備用。

1.2 四合木葉綠體DNA的提取和測序分析

傳統(tǒng)的植物葉綠體DNA提取主要包括從細(xì)胞中分離完整葉綠體、裂解葉綠體及純化葉綠體DNA三個基本步驟[15]，提取無核污染、純凈完整的葉綠體是整個過程的核心，主要的方法有很多[16]，本研究采用改良的蔗糖密度梯度離心法[17]。以分離提取四合木葉綠體DNA，具體改良步驟如下：(1)樣品采集后在緩沖液中預(yù)處理；(2)14 600轉(zhuǎn)下水平離心70 min；(3)葉綠體裂解提取DNA階段；(4)裂解后提取DNA進(jìn)行下一步的分離純化。

基于Nano Drop 2000微量分光光度計檢測cp DNA的濃度，并用0.8%的瓊脂糖電泳檢測cp DNA的質(zhì)量。采用Invitrogen生化DNA產(chǎn)物純化試劑盒，并對所提取的cp DNA進(jìn)一步純化以符合高通量測序要求。樣品經(jīng)北京諾和致源生物信息科技有限公司檢測合格后，采用Illumina雙末端測序技術(shù)進(jìn)行建庫測序，建庫類型為400 bp DNA小片段文庫，測序深度為10倍。

轉(zhuǎn)錄組Illumina HiSeq Xten測序由北京百邁客生物科技有限公司完成，得到原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Sequenced Reads)，結(jié)果以FASTQ(簡稱為fq)文件格式存儲，其中包含測序序列(Reads)的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。進(jìn)而對四合木基因組片段進(jìn)行定位、排序，確認(rèn)Contigs(重疊群)的鏈接順序，所有g(shù)aps(缺口)的填補通過選取引物、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步通過測序獲得，PCR產(chǎn)物符合之前預(yù)期，最終拼接獲得兩個完整的葉綠體基因組序列。

1.3 四合木葉綠體基因組組裝及注釋

采用Hahn等[18]的組裝方法，參考序列為同科植物三齒拉雷亞灌木(Larreatridentate)葉綠體基因組(KT272174)，最終得到四合木的葉綠體基因組序列(長度為106 259 bp)。共有96 237條葉綠體reads參與組裝，平均覆蓋率為134.6X。采用SOAPdenovo 2.04軟件(http://soap.genomics.org.cn/soap denovo.html)進(jìn)行組裝[19]，多次調(diào)整得出最優(yōu)結(jié)果[18]。采用與GenBank現(xiàn)有近緣種三齒拉雷亞灌木(L.tridentate)(KT272174)等葉綠體基因組比對的方式進(jìn)行注釋。將注釋好的四合木葉綠體基因組各個蛋白質(zhì)編碼基因堿基序列的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)閒asta格式文件，導(dǎo)入Sequin軟件。并檢驗轉(zhuǎn)換文件內(nèi)存在的錯誤對其更正，在確定無誤之后逐個添加rRNA與tRNA基因，導(dǎo)出為GeneBank格式序列文件的結(jié)果，提交序列文件至NCBI(National Center for Biotechnology Information)的網(wǎng)站(http://www.ncbi.nml.nih.Gov/)的GeneBank(基因文庫)，最終得到基因組序列號(MH325021)，采用OGDraw在線工具(http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/)[20]進(jìn)行基因組圖譜繪制。

1.4 四合木葉綠體基因數(shù)據(jù)及其系統(tǒng)發(fā)育分析

利用mVISTA軟件[21]，在Shuffle-LAGAN模型下，將四合木葉綠體基因組與三齒拉雷亞灌木(L.tridentate)、鳳仙花(Francoasonchifolia)、高桂花(Hypseocharisbilobata)3種植物的葉綠體基因組進(jìn)行序列比較分析。mVISTA是用于多個DNA序列比對的在線工具，可通過比較編碼區(qū)與非編碼區(qū)、內(nèi)含子和外顯子來評估序列的相似性[22]。利用BLAST軟件分析四合木葉綠體基因組蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence，CDs)與其他三種植物的相似性。

我國的《中國植物志》[23]將四合木歸為牻牛兒苗目(Geraniales)，而國外的分類系統(tǒng)則將四合木歸為蒺藜目(Zygophyllales)(http://www.catalogueoflife.Org/annual-checklist/2014/details/species/id/16739396)。因此選取GenBank現(xiàn)有29種牻牛兒苗目和1種蒺藜目植物及四合木共31個物種的葉綠體基因組，使用軟件Clustalw對31個由蛋白質(zhì)序列連接形成的子集。經(jīng)行多重序列比對，結(jié)果經(jīng)手工檢查與調(diào)整后。用近鄰結(jié)合法(neighbor-joining，NJ)法對系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。采用MEGA6軟件[24]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(自舉值Bootstrap value設(shè)為1000)。將自舉置信大于50%的進(jìn)化枝顯示在系統(tǒng)進(jìn)化樹中。

2 結(jié)果與分析

2.1 四合木堿基類型及其數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計

測序得到的數(shù)據(jù)，經(jīng)低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾后，最終得到Clean_Reads，以保證信息的質(zhì)量。然后進(jìn)行堿基類型分布檢查。堿基類型分布檢查用于檢測有無AT、GC分離現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象可能是測序或者建庫所帶來的，并且會影響后續(xù)分析。高通量所測序列為基因組隨機(jī)打斷后的DNA片段，由于位點在基因組上的分布是近似均勻的，同時，G/C、A/T含量也是近似均勻的。因此，根據(jù)大數(shù)定理，在每個測序循環(huán)上，GC、AT含量應(yīng)當(dāng)分別相等，且等于基因組的GC、AT含量。同樣因為重疊簇的關(guān)系會導(dǎo)致樣品前幾個堿基AT、GC不等波動較大，高于其他測序區(qū)段，而其它區(qū)段的GC、AT的含量相等，且分布均勻無分離現(xiàn)象。堿基類型分布圖，其中橫坐標(biāo)為reads的堿基位置，縱坐標(biāo)為堿基所占的比例，前150 bp為雙端測序序列的第一端測序Reads的堿基分布，后150 bp為另一端測序reads的堿基分布。每個bp代表測序的每個堿基，如第一bp即表示該項目所有測序reads在第一個堿基的A、T、G、C的分布情況。由圖1所示，A和G、C和T的含量非常接近，且N的含量接近0，這說明四合木的測序質(zhì)量較好。

2.2 四合木葉綠體基因組結(jié)構(gòu)分析

四合木葉綠體基因組總長度為106 259 bp，包含大單拷貝區(qū)(LSC)，小單拷貝區(qū)(SSC)，和兩個反向互補重復(fù)區(qū)(IRa和IRb)，其中大單拷貝區(qū)長80 390 bp，小單拷貝區(qū)長17 255 bp，IR區(qū)長8 614 bp(圖2)。從以上四合木葉綠體基因組圖譜中可以得到，編碼基因共98種，包括65種蛋白編碼基因、29種tRNA基因和4種rRNA基因；其中反向重復(fù)區(qū)IR區(qū)中有七種基因，包括四種PCG基因(RPL2，RPL23，RPS19，YCF15)，三種tRNA基因(TrNi-CaU，TrNL-CAA，TrNH-GUG)。

四合木葉綠體基因組全長106 259 bp，GC含量為33.6%，其結(jié)構(gòu)由4個區(qū)域組成，包括LSC區(qū)，SSC區(qū)及IR區(qū)，這四個區(qū)的長度分別為：80 390 bp，17 255和8 614 bp(表1，圖2)，GC含量較為均勻，LSC區(qū)含量最低，占比32.2%，SSC區(qū)占比37.4%，IRa區(qū)和IRb區(qū)占比最高，均為37.9%；葉綠體基因組注釋結(jié)果表明：四合木葉綠體中共注釋105個功能基因，包括64個蛋白編碼基因，32個tRNA基因和4個rRNA基因(表2)。四合木葉綠體基因組CDs的總長度為86 072 bp，占整個葉綠體基因組長度的81.0%。

圖1 堿基類型分布圖Fig.1 Distribution figure of base type

圖2 四合木葉綠體基因組圖譜Fig.2 Genome map of T.mongolica chloroplast

表1 四合木葉綠體基因組堿基組成

Table 1 Chloroplast genome composition ofT.mongolica

位置LocationT(U)(%)C(%)A(%)G(%)長度Length(bp)基因總長Total34.017.332.416.3106259大單拷貝區(qū)LSC33.015.734.716.580390小單拷貝區(qū)SSC30.517.331.920.117255反向重復(fù)區(qū)IR28.318.133.719.88614蛋白質(zhì)編碼區(qū)CDs30.816.932.619.786072

從以上四合木葉綠體基因組圖譜中tRNA中一共包含有10種基因(tna-ugc，tng-ucc，tni-gau，tnl-uaa，tnv-uac，clpp，rps1，rps12，rpl2，ATP f)。其中9種基因包含一個內(nèi)含子，而只有一種基因(ycf3)包含兩個內(nèi)含子。如圖2所示，在葉綠體基因組中，有4個rRNA基因(16S，23S，4.5S和5S)和28個tRNA基因(trnA-UGC，trnI-GAU，trnR-UCU，trnY-GUA，trnC-GCA，trnL-CAA，trnS-GCU，trnH-GUG，trnD-GUC，trnL-UAA，trnS-GGA，trnR-ACG，trnE-UUC，trnL-UAG，trnS-UGA，trnW-CCA，trnF-GAA，trnM-CAU，trnT-GGU，trnV-UAC，trnfM-CAU，trnN-GUU，trnT-UGU，trnQ-UUG，trnG-GCC，trnP-UGG，trnV-GAC，trnG-UCC)。

表2 四合木葉綠體基因組注釋基因信息

表3 四合木葉綠體基因組SSR序列

Table 3 The chloroplast genome SSR sequence ofT.mongolica

2.3 四合木葉綠體基因組SSR分析

葉綠體簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)是一種高效的分子標(biāo)記，其不僅具有標(biāo)記數(shù)量豐富、重復(fù)性高及共顯性遺傳等優(yōu)點，而且還兼具葉綠體基因組結(jié)構(gòu)簡單、單親遺傳及相對保守等特點，因此目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種鑒定及群體和個體水平的遺傳差異分析[25～26]。本研究中，我們在四合木中共計搜索到79個SSR位點，其中包括62個單核苷酸重復(fù)基序，6個二核苷酸重復(fù)基序，1個三核苷酸重復(fù)基序，9個四核苷酸重復(fù)基序，1個五核苷酸基序。在四合木所有的SSR中，重復(fù)最多的基序是A/T，然后依次是AT/AT，AAAT/ATTT，AATC/ATTG，這些重復(fù)基序占總數(shù)的94.6%(表3)。

單核苷酸重復(fù)在四合木葉綠體基因組SSR中占比78.48%，二核苷酸重復(fù)在四合木葉綠體基因組SSR中占比7.58%，三核苷酸重復(fù)在四合木葉綠體基因組SSR中占比1.27%，四核苷酸重復(fù)在四合木葉綠體基因組SSR中占比11.39%，五核苷酸重復(fù)在四合木葉綠體基因組SSR中占比1.27%。單核苷酸占比最多，三核苷酸和五核苷酸占比最少。在62個單核苷酸SSR中，包含A堿基SSR有30個，包含T堿基SSR有32個(表4)。

2.4 四合木葉綠體基因組IR邊界的收縮與擴(kuò)張分析

IR區(qū)對于植物葉綠體基因組長度的多樣性來說具有很重要的作用[27]，葉綠體基因組大小的差異主要體現(xiàn)在IR區(qū)邊界的收縮與擴(kuò)展[28]。通過對四合木近緣種4個物種的葉綠體基因組IR區(qū)邊界進(jìn)行比較(圖3)，發(fā)現(xiàn)IR邊界比較表明，大單拷貝區(qū)與反向重復(fù)區(qū)和小單拷貝區(qū)與反向重復(fù)區(qū)的邊界分布的基因包括rpl22，trnH-GUG，trnL-CAA，trnL-UAG，rpl32，psbA，rpl23，ycf1，rps15，ndhF，rpl2，ndhA。四個近緣物種邊界基因分布差異較大，不固定，四合木總長度較短(106 259 bp)，而雙葉黃耆最長(100 010 bp)，四合木LSC、IR相比其他物種最短，反而SSC最長，這與其他3個物種均不同。

序號Code重復(fù)類型SSR type簡單重復(fù)序列SSR大小Size起始Start終止End1p1(A)1313149215042p1(A)1010167216813p1(T)1212381638274p1(A)1010429643055c(A)12ttatcctc(T)1131444644766p1(A)1010585658657p1(T)1717613961558p1(T)141463716349p1(T)13136609662110p4(AAAT)3126763677411p1(T)10107086709512p1(A)15158685869913p1(T)14148837885014p1(A)1919104941051215c(T)12caaatccaaagaatttttattacttgatacataggtcatcgattcagcattctaaaaaaggaggttgttaaataaccca(T)10 acagagagggctcaaaagattttatCgatatgagtgttttctac-cgaaaaaaatttccaactattcttaattatgtcttaattatgaaattcaaaattc(T)12212112061141716p1(T)1414118961190917p1(T)1212169451695618p1(T)1111171241713419p1(T)1111176571766720p2(AT)510184971850621p1(A)1010211912120022p4(AAAT)312216142162523c(TA)5tgtaattaatttgg(A)1337256822571824p1(T)1010294982950725p1(A)1616302603027526p1(T)1414304403045327p4(ATTT)312311643117528p1(T)1010313413135029p1(T)1010344003440930c(A)10t(A)1122347883480931p1(A)1010354973550632p2(AT)510358493585833p1(T)1010362013621034p1(T)1111430294303935p1(T)1313449414495336p2(AT)510460204602937p1(A)1111461674617738p1(T)1111466454665539p1(A)1111472134722340p1(A)1010477234773241p1(T)1111484244843442p1(T)1111486484865843c(T)10caaccgaagaaaccccagAacctggaggagtagaattagttCtcataataataaaattaaatatgtctaaattttg(T)14100513775147644p1(T)1212521195213045p4(ATTG)312558245583546p1(A)1212559905600147p1(A)1212561295614048p2(AT)714563085632149p1(A)1010564635647250p2(TC)510574285743751p4(AAAG)312597505976152p1(T)1717614816149753p1(A)1313635926360454p1(A)1111640706408055p1(A)1111645216453156c(T)11aaacgagaatccttatttgtgTttgcctacttgaactcattttatttTtattcttgagttcattttttcaaattcaattcattcaat(A)10108649806508757p1(A)1313672936730558p2(AT)6126824968260

續(xù)表4 Continued table 4

序號Code重復(fù)類型SSR type簡單重復(fù)序列SSR大小Size起始Start終止End59p1(A)1515701497016360p4(AAAT)312715627157361p1(T)1010726777268662p1(T)1212729767298763p1(A)1010760327604164p1(T)1313762967630865p5(ATAAT)315769647697866p1(T)1010771327714167p1(A)1111775867759668p1(T)1010781717818069p1(T)1111786367864670p1(T)1616804038041871p4(TTAT)312854958550672p1(A)1010868168682573p4(TTGA)312874068741774p1(A)1414878088782175p1(T)1212880778808876p3(TTG)412888308884177p1(A)1111890528906278p1(T)1414894468945979p1(T)1515901659017980p1(A)1212906089061981p4(CTAC)312925049251582p1(A)1212982049821583p1(A)1313986979870984p1(A)1010991959920485p1(A)1616106232106247

注: p.單個SSR類型；p1/p2/p3中數(shù)字分別表示構(gòu)成基序的堿基個數(shù)；c.復(fù)合SSR類型

Note：p.Indicates single SSR type;The numbers in p1/p2/p3 indicate the number of bases constituting the motif，respectively; c.Indicates composite SSR type

圖4 基于31個物種進(jìn)行構(gòu)建的四合木系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 T.mongolica phylogenetic tree constructed based on 31 species

2.5 四合木葉綠體基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析

葉綠體基因組對于了解植物進(jìn)化等具有十分重要的價值[29]。為確定四合木的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究利用構(gòu)建鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)，選取31個物種進(jìn)行四合木的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，對四合木進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析確定四合木在植物中的系統(tǒng)進(jìn)化位置(圖4)。結(jié)果顯示，有22個節(jié)點的檢驗分值達(dá)到了100%，聚類結(jié)果的可靠性較高，如Pelargoninm、Geranium、Erodium、Monsonia等屬的物種均聚在了一起。本研究中，通過葉綠體基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)四合木與三齒拉雷亞灌木為最近，同屬蒺藜科，其次便是牻牛兒苗科智利白樺植物，與牻牛兒苗科天竺葵屬和牻牛兒苗科高桂花屬親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，然而，《中國植物志》和有花植物系統(tǒng)分類(APG Ⅳ)對于對于蒺藜科是否歸為牻牛兒苗目或者蒺藜目還有待進(jìn)一步研究。

3 討論

植物葉綠體基因組總長度一般約為107～218 kB，其中小單拷貝區(qū)長約18～20 kB，大單拷貝區(qū)約81～90 kB，2個反向重復(fù)區(qū)長約20～30 kB[30]。很多植物葉綠體結(jié)構(gòu)比較保守，但是其基因組大小卻不相同。葉綠體基因組的差異主要是由反向重復(fù)區(qū)的收縮與擴(kuò)張或者其缺失引起的[31]。反向重復(fù)區(qū)對于葉綠體基因組架構(gòu)的穩(wěn)定和大小方面起著十分重要的作用[32～33]。改良的高密度梯度離心法，經(jīng)顯微檢測，分離純化效果較為良好，無細(xì)胞碎片等雜質(zhì)的污染，這種方法可以保證所得四合木葉綠體基因組的可靠性，同時，也相對降低了成本。

本研究利用高通量測序技術(shù)對四合木葉綠體基因組進(jìn)行測序，通過分析可以發(fā)現(xiàn)，四合木葉綠體基因組全長106 259 bp，為一環(huán)狀DNA分子，同樣也是由4個區(qū)域(大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)和2個反向互補重復(fù)區(qū)(IR))構(gòu)成。且四合木葉綠體基因組高度保守，與多數(shù)被子植物一樣。通過對四合木共編碼98種基因，包括65種蛋白編碼基因、29種tRNA基因和4個rRNA基因。IR區(qū)中有七種基因，包括四種PCG基因(RPL2，RPL23，RPS19，YCF15)和三種tRNA基因(TrNi-CaU，TrNL-CAA，TrNH-GUG)，這七種基因位于紅外區(qū)域內(nèi)。tRNA中一共包含有10種(tna-ugc，tng-ucc，tni-gau，tnl-uaa，tnv-uac，clpp，rps1，rps12，rpl2，ATP-f)，9種基因包含1個內(nèi)含子，1種基因(ycf3)包含2個內(nèi)含子。98種基因按照功能可以分為4大類(自身復(fù)制所需基因、光合作用相關(guān)基因、其他功能基因和未知功能基因)。

四合木與其他被子植物相比，葉綠體基因組中重復(fù)序列較少，五個以上基因組中共統(tǒng)計出1個，所有重復(fù)序列中，最大的重復(fù)序列為18 bp，重復(fù)序列的數(shù)量與長度相比其他被子植物來說相對較短，例如禾本科植物有20多個重復(fù)，最長可達(dá)132 bp[34]。有研究表明，重復(fù)序列在基因組中扮演的角色也許很重要，其可以在某種條件下進(jìn)行重排和序列變異[27]，目前在四合木葉綠體基因組中沒有發(fā)現(xiàn)。對于四合木葉綠體基因組中SSR的統(tǒng)計結(jié)果顯示，四合木SSR中含有較多的AT，卻沒有發(fā)現(xiàn)GC，這種現(xiàn)象較少。

本研究為確定四合木的進(jìn)化地位和親緣關(guān)系，選取了GenBank現(xiàn)有29種牻牛兒苗目和1種蒺藜目植物葉綠體基因組，加上本研究得到的四合木共31個物種的葉綠體基因組，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)四合木與三齒拉雷亞灌木為最近的姐妹種，同屬蒺藜科，其次便是牻牛兒苗科智利白樺植物親緣關(guān)系較近，與牻牛兒苗科天竺葵屬和牻牛兒苗科高桂花屬親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。目前在國內(nèi)植物學(xué)教學(xué)過程中，沿用的仍然是傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)?！吨袊参镏尽分?，蒺藜科的四合木被分類到牻牛兒苗目[23]，然而，在國外的植物學(xué)科學(xué)研究和教學(xué)中被廣泛應(yīng)用的是APG植物分類系統(tǒng)[35]，蒺藜科的四合木被分類到了蒺藜目。對于是否將蒺藜科單獨作為一個目來進(jìn)行分類，還需要進(jìn)一步的研究。