冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄與炎癥標(biāo)志物及組織因子的關(guān)系

馬偉濤，夏大勝，夏偉，王麗，盧成志，何強(qiáng)

支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR）是經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）術(shù)后困擾臨床的一大難題。盡管已經(jīng)證實使用藥物洗脫支架（drug-eluting stents，DESs）可以抑制內(nèi)膜增生，降低 ISR 發(fā)生率[1]。但DESs 可影響內(nèi)皮化再生，ISR 的發(fā)生率仍高達(dá)10%左右[2]。炎癥參與動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，并影響其預(yù)后。激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，通過影響細(xì)胞因子及其他炎癥介質(zhì)的作用，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[3]。磷酸化c-jun是其主要活化形式，其數(shù)量可反映體內(nèi)AP-1水平[4]。CD40配體（CD40 ligand，CD40L）在血小板及單核細(xì)胞表面表達(dá)，促進(jìn)血小板的黏附及血栓的形成[5]。AP-1 及 CD40L 是體內(nèi)重要的炎癥標(biāo)志物。組織因子（tissue factor，TF）作為聯(lián)系炎癥與凝血途徑之間的橋梁，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展[6]。組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是 TF 的內(nèi)源性抑制因子，可特異性地抑制TF介導(dǎo)的血栓形成過程及炎癥過程，參與動脈粥樣硬化過程。越來越多的證據(jù)表明，低度慢性炎癥是ISR發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。目前有關(guān)TF與冠狀動脈ISR相關(guān)性的研究尚少見。本研究旨在分析PCI術(shù)后ISR與炎癥標(biāo)志物c-jun、CD40L及TF、TFPI的關(guān)系，并探討發(fā)生ISR的可能影響因素。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年12月—2017年6月因冠心病就診于天津市第一中心醫(yī)院并行PCI的患者200例，其中男161例，女39例，年齡43～78歲，平均（57.12±6.83）歲。經(jīng)臨床癥狀及冠脈造影明確冠心病診斷，并符合中華醫(yī)學(xué)會2007年冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)并行PCI術(shù)。所有研究對象在完全了解本研究并簽署知情同意書后方可入組。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重感染性疾病、重度心力衰竭、惡性腫瘤、慢性肝腎功能不全、結(jié)締組織疾病。

1.2 一般臨床資料收集 收集所有研究對象的一般臨床資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、吸煙史、高血壓、糖尿病病史。所有患者均隔夜禁食12 h，于次日清晨7：00采集空腹肘正中靜脈血5 mL，以3 000 r/min 離心15 min 后分離血清，置于-80 ℃冰箱中待檢。采用德國COBAS MODULAR DPP 全自動生化分析儀測定患者總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）水平。

1.3 PCI的實施 由臨床經(jīng)驗豐富的心內(nèi)科介入醫(yī)師操作，采用標(biāo)準(zhǔn)Judkin’s 法經(jīng)橈動脈或股動脈入路行冠脈造影+PCI 術(shù)。記錄所用支架的直徑及長度。根據(jù)改良的Gensini積分評分標(biāo)準(zhǔn)，對每支冠脈血管的病變狹窄程度進(jìn)行計量評估。Gensini積分計算方法：將冠狀動脈分成14段，當(dāng)冠狀動脈狹窄0～25%時權(quán)重系數(shù)為1，冠狀動脈狹窄26%～49%時為2，狹窄50%～74%時為4，狹窄75%～89%時為8，狹窄90%～99%時為16，狹窄100%時為32；根據(jù)冠狀動脈病變的不同節(jié)段確定權(quán)重系數(shù)，左主干病變?yōu)?，前降支近段、回旋支近段為2.5，前降支中段為1.5，右冠狀動脈、前降支遠(yuǎn)段、回旋支遠(yuǎn)段、左心室后側(cè)支、鈍緣支動脈、第1對角支、心尖支為1.0，第2 對角支為0.5?？偡譃楣跔顒用}管腔狹窄程度權(quán)重系數(shù)乘以各病變血管的權(quán)重系數(shù)之和。

1.4 冠脈ISR的判斷與檢測 PCI術(shù)后規(guī)律服用雙聯(lián)抗血小板聚集、調(diào)脂等藥物治療。術(shù)后1年復(fù)查冠脈造影。判斷是否發(fā)生ISR，并根據(jù)判定結(jié)果分為ISR組與對照組。冠脈ISR定義：應(yīng)用冠脈定量測定法測定，支架遠(yuǎn)端與近端、支架內(nèi)距支架邊緣≤5 mm，支架植入段狹窄程度≥50%。

1.5 磷酸化c-jun、TF、TFPI 指標(biāo)檢測 所有患者于復(fù)查冠脈造影時采集空腹肘正中靜脈血5 mL，以3 000 r/min 離心15 min 后分離血清，置于-80 ℃冰箱中待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測外周血白細(xì)胞裂解液中磷酸化c-jun 吸光度（A）值及TF、TFPI 水平，磷酸化c-jun 試劑盒購自美國CST 公司、TF、TFPI試劑盒購自美國ADI公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 血小板表面CD40L測定 所有患者于復(fù)查冠脈造影時采集肘正中靜脈血2 mL，加入含1%的EDTA抗凝試管中，全血檢測血小板CD40L。流式抗體FTIC Mouse IgGκ 及FTIC anti-human CD40L 購自美國BD PharMingen 公司，按說明書要求進(jìn)行操作。取2 支FALCON 管，分別標(biāo)記（+）和（-），兩管均加入標(biāo)本（E-DTA-K2抗凝靜脈血）5 μL。向（-）管中加入FTIC Mouse IgGκ 20 μL，向（+）管中加入FTIC anti-human CD40L 20 μL混勻。室溫避光靜置30 min。每管加入生理鹽水2 mL，混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清。再向每管加入生理鹽水1 mL，混勻，通過流式細(xì)胞儀統(tǒng)計血小板膜CD40L平均熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，2 組間比較采用χ2檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)；不符合正態(tài)分布的計量資料相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。ISR的影響因素采用Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組一般資料比較 PCI 術(shù)后1年復(fù)查冠脈造影，ISR 組 27 例，對照組 173 例。ISR 組吸煙、糖尿病、Gensini 積分、支架長度、TC 及 LDL-C 水平均高于對照組（P＜0.05）。2組間年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、高血壓、支架直徑、TG及HDL-C比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 2 組患者磷酸化 c-jun、CD40L、TF、TFPI 及 TF/TFPI 水平的比較 ISR 組磷酸化c-jun、血小板CD40L熒光強(qiáng)度、TF、TFPI及TF/TFPI水平均高于對照組（P＜0.01），見表2。

2.3 ISR 組患者磷酸化 c-jun 與 CD40L、TF 及 TFPI相關(guān)性分析 磷酸化c-jun 水平與血小板CD40L 熒光強(qiáng)度、TF及TFPI均呈正相關(guān)（rs分別為0.766、0.496、0.540，P＜0.05）。血小板CD40L 熒光強(qiáng)度與TF及TFPI均呈正相關(guān)（r分別為0.652、0.702，P＜0.05）。

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups表1 2組間一般臨床資料的比較

Tab.2 Comparison of the levels of phosphorylated c-Jun，CD40L，TF，TFPI and TF/TFPI between two groups表2 2組患者磷酸化c-jun、CD40L、TF、TFPI及TF/TFPI水平的比較

2.4 ISR 發(fā)生的多因素Logistic 回歸分析結(jié)果 以是否出現(xiàn)ISR（是=1，否=0）為因變量，以年齡、性別（男=1，女=0）、吸煙史（有=1，無=0）、糖尿病史（有=1，無=0）、高血壓病史（有=1，無=0）、BMI、TC、TG、LDL-C、HDL-C、支架長度、支架直徑、磷酸化c-jun、血小板CD40L熒光強(qiáng)度、TF、TFPI及TF/TFPI水平為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病、高TC、高血小板CD40L 熒光強(qiáng)度、高TF/TFPI及植入支架長度較長是發(fā)生ISR 的危險因素（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Multivariate Logistic regression analysis of ISR表3 ISR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

ISR是影響PCI遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素，其病理生理過程復(fù)雜，主要包括受損血管重構(gòu)、炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞增殖遷移3個階段。血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)是ISR 的起始環(huán)節(jié)，血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移、血管新生內(nèi)膜過度增厚是ISR的中心環(huán)節(jié)[8]。炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是ISR 的重要機(jī)制之一。PCI 術(shù)后局部內(nèi)皮損傷會激活炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)血栓形成，造成ISR，同時促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，加重ISR[9]。目前有關(guān)ISR與炎癥標(biāo)志物AP-1、CD40L及TF關(guān)系的研究較少。

既往研究表明，AP-1影響絲裂原活化蛋白激酶信號通路，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)炎癥因子及內(nèi)皮素-1的釋放，在ISR中起重要作用[10]。AP-1可促進(jìn)其下游通路基質(zhì)金屬蛋白酶- 2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達(dá)，而其內(nèi)源性抑制劑組織金屬蛋白酶抑制物-2表達(dá)雖代償性增加，但增加幅度有限，不足以抵消MMP-2 的作用。MMP-2 調(diào)節(jié)基質(zhì)降解和平滑肌細(xì)胞遷移，從而在ISR 中發(fā)揮作用[11]。Buchwald 等[12]研究顯示，應(yīng)用抗AP-1 誘餌寡脫氧核苷酸治療能顯著減小高膽固醇血癥小型豬冠狀動脈中的新生內(nèi)膜厚度，提示抗AP-1 結(jié)合位點(diǎn)的誘餌寡核苷酸能有效抑制內(nèi)膜再生，減少ISR 發(fā)生率。本研究結(jié)果顯示，ISR 組血清磷酸化c-jun 水平較對照組升高，而Logistic 回歸分析未提示磷酸化c-jun是ISR的影響因素，推測可能與樣本量較少或CD40L、TF、TFPI 的相互影響有關(guān)，在后續(xù)研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量，并減少各因素的相互影響程度。

CD40L 是腫瘤壞死因子超家族的成員之一，具有趨化因子的活性。CD40L系統(tǒng)廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血小板表面。CD40L 與CD40 結(jié)合后通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞黏附分子和TF 參與炎癥、血栓形成和動脈粥樣硬化，在動脈粥樣硬化病變進(jìn)展和炎癥過程中起著重要作用[13]。有研究表明CD40/CD40L 通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等的表達(dá)來使動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定，并參與多種炎癥反應(yīng)病理生理過程，從而導(dǎo)致ISR 的發(fā)生[14]。Yan 等[15]通過間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)分析120例PCI患者和20例正常對照者的血小板CD40L水平，PCI術(shù)后隨訪6個月，觀察ISR的發(fā)生情況。結(jié)果顯示，發(fā)生ISR 者的血小板CD40L 水平明顯升高。本研究結(jié)果顯示，ISR 組CD40L 水平較對照組明顯升高，且高CD40L 水平是發(fā)生ISR的危險因素，與以往研究結(jié)果一致。

TF又稱凝血因子Ⅲ，與Ⅶa結(jié)合，為外源性凝血途徑啟動的關(guān)鍵因子。TF/Ⅶa促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時通過調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞的增殖和遷移，參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展[16]。而TFPI 通過與TF-Ⅶa復(fù)合物結(jié)合，抑制凝血過程。一項旨在探討TFPI涂層支架在抑制兔頸動脈模型再狹窄中有效性和安全性的研究表明，TFPI包被的支架可以成功地將TFPI基因轉(zhuǎn)染到血管壁細(xì)胞中，從而在兔頸動脈模型中抑制再狹窄且未發(fā)生明顯的不良反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示，ISR 組 TF、TFPI 及 TF/TFPI 水平較對照組明顯升高，提示ISR 患者TF 水平升高，TFPI 水平雖有代償性升高，但不足以抵消TF 作用。另外，高TF/TFPI 水平是發(fā)生ISR 的危險因素。與以往研究相比，明確了TF/TFPI在ISR發(fā)生中的作用。本研究中磷酸化c-jun 水平與血小板CD40L 熒光強(qiáng)度、TF 及TFPI 均呈正相關(guān)，血小板CD40L 熒光強(qiáng)度與TF 及TFPI呈正相關(guān)。有研究表明CD40/CD40L可通過激活體內(nèi)二酰基甘油—蛋白激酶C信號通路上調(diào)炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞TF 的表達(dá)[18]。而CD40L誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞中TF的表達(dá)是通過AP-1介導(dǎo)的[19]。因此，筆者推測 CD40L 是通過 AP-1 介導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)，參與ISR過程。

綜上所述，炎癥標(biāo)志物磷酸化c-jun、CD40L 及TF促進(jìn)冠心病患者PCI術(shù)后ISR的發(fā)生。