外源性褪黑素對尼古丁處理雄性大鼠生育能力的影響

胡皓睿，楊衛(wèi)民，黃繪，廖明，周曉明

目前研究認(rèn)為男性不育與吸煙有顯著關(guān)聯(lián)[1]。而尼古丁是香煙中毒性最大的化合物，對女性和男性生殖系統(tǒng)均有不良影響[2-3]。多項(xiàng)研究表明，尼古丁可減少睪酮和黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）等釋放[2，4]。尼古丁通過影響正常形態(tài)精子的數(shù)量、運(yùn)動和生存，從而降低男性的生育能力[5]。另外，尼古丁攝入量均與生殖系統(tǒng)細(xì)胞凋亡增加相關(guān)，且沒有性別差異[6]。高抗氧化化合物可有效減少尼古丁作用，褪黑素具有強(qiáng)大的抗氧化活性。男性的褪黑素被睪丸吸收，可調(diào)節(jié)睪丸活動，也可調(diào)節(jié)睪丸中細(xì)胞生長、有絲分裂和間質(zhì)細(xì)胞的分泌[7]?；?、糖尿病和高脂血癥等因素可影響褪黑素對睪丸的保護(hù)作用[8]。目前尼古丁對于男性生殖系統(tǒng)的影響已有較多報(bào)道，然而褪黑素對尼古丁處理睪丸的影響尚少見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在評估褪黑素對尼古丁處理大鼠精子發(fā)生、精子核完整性和附睪精子參數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 32 只清潔級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心（許可證號：SCXK2013-0001）。正常鼠糧飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，且每周更換墊料；每日光照12 h，黑暗12 h。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組，每組8 只。A 組為對照組，腹腔注射生理鹽水（10 mL/kg）；B 組腹腔注射尼古丁1 mg/kg；C 組腹腔注射褪黑素10 mg/kg；D組腹腔注射尼古丁1 mg/kg+褪黑素10 mg/kg，各組均每日注射1 次，持續(xù)30 d。尼古丁在給藥前用生理鹽水稀釋為0.5 g/L。褪黑素使用前先用無水乙醇溶解，然后加生理鹽水稀釋為5 g/L。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 石蠟切片機(jī)（深圳永年科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展公司）；褪黑素（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；尼古丁酒石酸鹽、福爾馬林和HE染料（美國Sigma 公司）；低熔點(diǎn)瓊脂糖（上海谷研生物科技有限公司）；DNA 完整性檢測試劑盒（深圳博銳德生物科技有限公司）；TUNEL 染色試劑盒、睪酮和LH 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 精子發(fā)生分析 所有大鼠在31 d通過頸椎脫位處死，切除睪丸和附睪。右側(cè)睪丸采用10%福爾馬林固定，脫水及石蠟包埋。然后制備5 μm切片并進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下評估精子發(fā)生情況。通過Johnsen評分法對精子質(zhì)量和成熟度進(jìn)行評估[8]。生精細(xì)胞包括精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子。觀察各組生精小管結(jié)構(gòu)、小管內(nèi)各級生精細(xì)胞數(shù)量等變化。連續(xù)觀察100個(gè)生精小管，計(jì)算其平均分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 TUNEL染色 右側(cè)睪丸通過10%福爾馬林固定，脫水及石蠟包埋，制備5 μm 石蠟切片。按照TUNEL 染色試劑盒說明書檢測各組大鼠睪丸上細(xì)胞凋亡情況。在光學(xué)顯微鏡下，每只小鼠取20個(gè)生精小管橫截面進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.3 ELISA分析 大鼠處死后立即從下腔靜脈采血1 mL。靜置1 h后離心，分離血清，并置于-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA 法檢測血清睪酮和LH 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 附睪精子參數(shù) 取大鼠附睪尾部置于3 mL 37 ℃生理鹽水中，剪碎并靜置1 min，制成精子混懸液。采用WL-9000型精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)檢測精子的活力及密度等。采用改良巴氏染色法染色，對精子懸液涂片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析[10]。

1.2.5 精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 按照精子DNA 完整性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。取大鼠附睪尾部置于3 mL 37 ℃生理鹽水中，剪碎并靜置1 min，制成精子混懸液。70 μL 低熔點(diǎn)瓊脂糖融化于65～90 ℃水中，在37 ℃下放置3 min，然后加入30 μL 精子溶液，混合均勻。吸取10 μL 配制好的精液置于0.65%瓊脂澆制載玻片上，蓋上蓋玻片，在4 ℃冰箱中放置4 min。去除蓋玻片，22 ℃下放入0.08 mol/L HCl 內(nèi)7 min，然后置于變性液（包括2-巰基乙醇、酸性Tris、鈉十二烷基硫酸鹽、乙二胺四乙酸和氯化鈉）中25 min。標(biāo)本片用蒸餾水沖洗2次。將混勻好的染液滴加到玻片上，染色5 min。在常規(guī)顯微鏡400 倍鏡下觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，觀察精子光暈，有光暈表示精子DNA完整，根據(jù)形態(tài)分為大、小光暈；無光暈表示精子DNA 斷裂。DNA 碎片指數(shù)=DNA 斷裂精子/全部精子×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行Tukey 檢驗(yàn)；變量間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)和Johnsen 評分比較 （1）生精細(xì)胞計(jì)數(shù)。與A 組比較，B 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少；C 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)與A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D 組次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞個(gè)數(shù)少于A 組，精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和精子個(gè)數(shù)與A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C 組和D 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)均多于B 組，C 組與D 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）Johnsen 評分。B 組 Johnsen 評分低于 A 組，C 組和 D組 Johnsen 評分均高于 B 組，C 組與 D 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 各組大鼠生精小管中細(xì)胞凋亡情況比較 A、B、C 和D 組大鼠生精小管中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為5.46±0.43、13.84±0.87、7.26±0.57、7.73±0.46，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=287.658，P＜0.05）；B 組較A、C和D 組明顯增加（P＜0.05），A、C 和D 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡細(xì)胞主要見于初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞，見圖1。

2.3 各組大鼠LH 和睪酮水平比較 B 組和D 組大鼠血清LH和睪酮水平較A組顯著降低（P＜0.05），C組大鼠血清LH 和睪酮水平與A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較B組升高（P＜0.05）。D組大鼠血清LH水平與B組和C組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組睪酮水平高于B 組（P＜0.05），與C 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2.4 各組大鼠附睪精子參數(shù)比較 與A 組比較，B組大鼠附睪精子計(jì)數(shù)和活力均降低，而異常形態(tài)比例升高（P＜0.05）；與B組比較，C組和D組大鼠附睪精子計(jì)數(shù)和活力均增加，而異常形態(tài)降低（P＜0.05）；D組除大鼠附睪精子緩慢前進(jìn)比例低于C組、不動比例高于C 組外，其余參數(shù)與C 組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)和Johnsen評分比較 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)和Johnsen評分比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F生精細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)）精原細(xì)胞11.37±0.54 9.81±0.35a 11.53±0.57b 10.14±0.46b 25.253＊初級精母細(xì)胞23.36±0.38 15.02±0.55a 21.53±0.79b 20.15±0.64b 397.911＊次級精母細(xì)胞35.26±0.53 18.63±0.68a 33.54±0.97b 27.38±1.03ab 659.061＊精子細(xì)胞121.37±0.95 95.57±2.28a 118.54±1.36b 109.73±2.29ab 326.291＊精子83.86±3.17 67.56±1.85a 82.56±1.67b 79.14±2.76b 73.818＊Johnsen評分（分）9.54±0.07 8.36±0.18a 9.34±0.06b 9.06±0.07ab 185.917＊

Fig.1 Immunostaining of seminiferous tubules(TUNEL,×400)圖1 生精小管的免疫染色（TUNEL，×400）

Fig.2 Effects of nicotine and melatonin on serum testosterone and LH levels圖2 尼古丁和褪黑素對大鼠血清LH和睪酮的影響

Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素對附睪精子參數(shù)的影響 （n=8，±s）

Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素對附睪精子參數(shù)的影響 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F計(jì)數(shù)（×106/mL）32.53±1.47 23.45±0.76a 33.09±0.87b 29.83±0.81b 150.877＊快速前進(jìn)（%）10.14±0.16 2.40±0.23a 12.53±0.16b 8.63±0.07b 5 474.09＊緩慢前進(jìn)（%）38.45±2.17 30.24±2.84a 44.26±2.27b 35.42±2.56bc 44.914＊不動（%）15.13±0.26 30.43±0.45a 10.52±2.47b 18.63±2.96abc 153.115＊總活力（%）63.96±1.25 41.08±1.36a 67.64±1.95b 63.76±2.67b 329.514＊異常形態(tài)（%）27.54±1.17 45.54±0.86a 25.86±0.58b 29.65±1.06b 735.802＊

2.5 各組大鼠精子染色質(zhì)完整性比較 與A 組比較，B組光暈精子比例顯著降低，DNA碎片指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與B 組比較，C 組和D 組光暈精子比例均升高，DNA碎片指數(shù)均降低（P＜0.05）。D組光暈精子比例與C 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DNA 碎片指數(shù)較C組升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素對雄性大鼠精子染色質(zhì)完整性影響（n=8，±s）

Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素對雄性大鼠精子染色質(zhì)完整性影響（n=8，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F光暈精子（%）73.26±1.02 55.87±1.26a 73.64±1.57b 62.51±2.08ab 255.419＊DNA碎片指數(shù)（%）12.26±0.54 32.25±0.83a 10.56±0.75b 20.27±0.85bc 1382.947＊

2.6 相關(guān)性分析 DNA碎片指數(shù)與血清睪酮水平、LH 水平和精子總活力呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.894、-0.763、-0.786，均P＜0.05），與生殖細(xì)胞凋亡、精子異常形態(tài)呈正相關(guān)（r分別為0.782、0.837，均P＜0.05）。

3 討論

尼古丁為3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑，在睪酮代謝及前列腺中雄激素變化等方面發(fā)揮重要作用[3]。以往研究表明，尼古丁可通過降低精子數(shù)量、形態(tài)、活力和睪丸質(zhì)量從而在不孕癥中發(fā)揮作用[11]。本研究對成年雄性大鼠腹腔注射尼古丁，尼古丁劑量為1 mg/kg，相當(dāng)于成人每天抽20支煙的血清尼古丁水平[6]。注射30 d后，大鼠精子發(fā)生、生殖細(xì)胞凋亡、精子參數(shù)和精子染色質(zhì)完整性均發(fā)生變化。上述效應(yīng)的可能原因是，尼古丁可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而抑制垂體促性腺激素釋放[11]；而垂體促性腺激素變化又會引起睪丸精子發(fā)生和類固醇生成改變。

精子發(fā)生是一種激素調(diào)節(jié)過程，特別是睪酮和促性腺激素，如卵泡刺激素和LH[12]。本研究結(jié)果顯示，尼古丁處理大鼠血清睪酮和LH 水平顯著降低。睪酮是精子發(fā)生啟始及維持的關(guān)鍵激素。LH 是由垂體分泌的，影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞并刺激其分泌睪酮。因此，LH水平降低后，睪酮水平也相應(yīng)降低，本研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。另外，本研究結(jié)果顯示，尼古丁處理后大鼠生精細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少，生精小管中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增多，這可能與尼古丁自身毒性以及睪酮和LH水平降低有關(guān)；也可能與尼古丁處理后大鼠體內(nèi)氧化劑，如過氧化氫水平較高有關(guān)。目前已經(jīng)證明，尼古丁可減少睪丸抗氧化水平，并增加睪丸脂質(zhì)過氧化作用[5]。

另外，本研究對精子染色質(zhì)完整性進(jìn)行了評估，以往研究僅通過精子參數(shù)評價(jià)男性生育狀況是不全面的[12]。精子DNA損傷程度與生育率降低相關(guān)[12]；而且氧化應(yīng)激在單鏈和雙鏈DNA 斷裂中發(fā)揮重要作用[13]。Condorelli等[14]研究指出，尼古丁通過降低精子染色質(zhì)DNA完整性使精子活力和數(shù)量減少，并呈劑量和時(shí)間依賴性。有研究報(bào)道，精子活力和精子DNA 損傷也存在顯著的負(fù)相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，尼古丁可使精子形態(tài)異常及精子DNA斷裂增加；且DNA碎片指數(shù)與血清睪酮水平、LH水平和精子總活力呈負(fù)相關(guān)，與以往研究結(jié)果基本一致。

褪黑素是一種主要由松果體和其他器官合成的激素，如視網(wǎng)膜及淚腺。睪丸組織中褪黑素濃度與身體其他組織中類似[12]。研究表明，褪黑素具有抗氧化和捕獲自由基的能力[12]。體外研究表明，褪黑素也可改善化療小鼠精子發(fā)生和精子參數(shù)[16]，褪黑素處理可提高精液質(zhì)量[17]。上述研究提示褪黑素對精子具有保護(hù)作用。本研究中褪黑素劑量為10 mg/kg，與文獻(xiàn)[2]中的劑量相同，結(jié)果顯示，褪黑素可改善尼古丁處理大鼠精子發(fā)生和精子參數(shù)，可能與褪黑素的抗凋亡和抗氧化作用有關(guān)。褪黑素也可影響下丘腦-垂體-性腺軸和調(diào)節(jié)性激素分泌，如雌激素、睪酮和LH。本研究中褪黑素也可顯著提高睪酮和LH水平，并改善DNA碎片指數(shù)，提示可能與褪黑素對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的直接作用有關(guān)。此外，褪黑素也可改善尼古丁處理大鼠精子染色質(zhì)完整性，提示精液中褪黑素可能與睪酮和抗氧化酶之間存在關(guān)聯(lián)[18]。

綜上所述，褪黑素可通過減少生殖細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)睪酮水平改善尼古丁處理大鼠精子發(fā)生數(shù)量、質(zhì)量和精子染色質(zhì)完整性，但其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。