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    外源性褪黑素對尼古丁處理雄性大鼠生育能力的影響

    2019-07-17 05:52:22胡皓睿楊衛(wèi)民黃繪廖明周曉明
    天津醫(yī)藥 2019年6期
    關(guān)鍵詞:精子發(fā)生生精尼古丁

    胡皓睿,楊衛(wèi)民,黃繪,廖明,周曉明

    目前研究認(rèn)為男性不育與吸煙有顯著關(guān)聯(lián)[1]。而尼古丁是香煙中毒性最大的化合物,對女性和男性生殖系統(tǒng)均有不良影響[2-3]。多項(xiàng)研究表明,尼古丁可減少睪酮和黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)等釋放[2,4]。尼古丁通過影響正常形態(tài)精子的數(shù)量、運(yùn)動和生存,從而降低男性的生育能力[5]。另外,尼古丁攝入量均與生殖系統(tǒng)細(xì)胞凋亡增加相關(guān),且沒有性別差異[6]。高抗氧化化合物可有效減少尼古丁作用,褪黑素具有強(qiáng)大的抗氧化活性。男性的褪黑素被睪丸吸收,可調(diào)節(jié)睪丸活動,也可調(diào)節(jié)睪丸中細(xì)胞生長、有絲分裂和間質(zhì)細(xì)胞的分泌[7]?;?、糖尿病和高脂血癥等因素可影響褪黑素對睪丸的保護(hù)作用[8]。目前尼古丁對于男性生殖系統(tǒng)的影響已有較多報(bào)道,然而褪黑素對尼古丁處理睪丸的影響尚少見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在評估褪黑素對尼古丁處理大鼠精子發(fā)生、精子核完整性和附睪精子參數(shù)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 32 只清潔級雄性SD 大鼠,體質(zhì)量180~220 g,購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心(許可證號:SCXK2013-0001)。正常鼠糧飼養(yǎng),自由飲水和攝食,且每周更換墊料;每日光照12 h,黑暗12 h。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組,每組8 只。A 組為對照組,腹腔注射生理鹽水(10 mL/kg);B 組腹腔注射尼古丁1 mg/kg;C 組腹腔注射褪黑素10 mg/kg;D組腹腔注射尼古丁1 mg/kg+褪黑素10 mg/kg,各組均每日注射1 次,持續(xù)30 d。尼古丁在給藥前用生理鹽水稀釋為0.5 g/L。褪黑素使用前先用無水乙醇溶解,然后加生理鹽水稀釋為5 g/L。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 石蠟切片機(jī)(深圳永年科技有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展公司);褪黑素(上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司);尼古丁酒石酸鹽、福爾馬林和HE染料(美國Sigma 公司);低熔點(diǎn)瓊脂糖(上海谷研生物科技有限公司);DNA 完整性檢測試劑盒(深圳博銳德生物科技有限公司);TUNEL 染色試劑盒、睪酮和LH 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 精子發(fā)生分析 所有大鼠在31 d通過頸椎脫位處死,切除睪丸和附睪。右側(cè)睪丸采用10%福爾馬林固定,脫水及石蠟包埋。然后制備5 μm切片并進(jìn)行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下評估精子發(fā)生情況。通過Johnsen評分法對精子質(zhì)量和成熟度進(jìn)行評估[8]。生精細(xì)胞包括精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子。觀察各組生精小管結(jié)構(gòu)、小管內(nèi)各級生精細(xì)胞數(shù)量等變化。連續(xù)觀察100個(gè)生精小管,計(jì)算其平均分,評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[9]。

    1.2.2 TUNEL染色 右側(cè)睪丸通過10%福爾馬林固定,脫水及石蠟包埋,制備5 μm 石蠟切片。按照TUNEL 染色試劑盒說明書檢測各組大鼠睪丸上細(xì)胞凋亡情況。在光學(xué)顯微鏡下,每只小鼠取20個(gè)生精小管橫截面進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均數(shù)。

    1.2.3 ELISA分析 大鼠處死后立即從下腔靜脈采血1 mL。靜置1 h后離心,分離血清,并置于-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA 法檢測血清睪酮和LH 水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

    1.2.4 附睪精子參數(shù) 取大鼠附睪尾部置于3 mL 37 ℃生理鹽水中,剪碎并靜置1 min,制成精子混懸液。采用WL-9000型精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)檢測精子的活力及密度等。采用改良巴氏染色法染色,對精子懸液涂片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析[10]。

    1.2.5 精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 按照精子DNA 完整性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。取大鼠附睪尾部置于3 mL 37 ℃生理鹽水中,剪碎并靜置1 min,制成精子混懸液。70 μL 低熔點(diǎn)瓊脂糖融化于65~90 ℃水中,在37 ℃下放置3 min,然后加入30 μL 精子溶液,混合均勻。吸取10 μL 配制好的精液置于0.65%瓊脂澆制載玻片上,蓋上蓋玻片,在4 ℃冰箱中放置4 min。去除蓋玻片,22 ℃下放入0.08 mol/L HCl 內(nèi)7 min,然后置于變性液(包括2-巰基乙醇、酸性Tris、鈉十二烷基硫酸鹽、乙二胺四乙酸和氯化鈉)中25 min。標(biāo)本片用蒸餾水沖洗2次。將混勻好的染液滴加到玻片上,染色5 min。在常規(guī)顯微鏡400 倍鏡下觀察結(jié)果,計(jì)數(shù)200 個(gè)精子,觀察精子光暈,有光暈表示精子DNA完整,根據(jù)形態(tài)分為大、小光暈;無光暈表示精子DNA 斷裂。DNA 碎片指數(shù)=DNA 斷裂精子/全部精子×100%。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間多重比較行Tukey 檢驗(yàn);變量間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)和Johnsen 評分比較 (1)生精細(xì)胞計(jì)數(shù)。與A 組比較,B 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少;C 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)與A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D 組次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞個(gè)數(shù)少于A 組,精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和精子個(gè)數(shù)與A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;C 組和D 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)均多于B 組,C 組與D 組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)Johnsen 評分。B 組 Johnsen 評分低于 A 組,C 組和 D組 Johnsen 評分均高于 B 組,C 組與 D 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

    2.2 各組大鼠生精小管中細(xì)胞凋亡情況比較 A、B、C 和D 組大鼠生精小管中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為5.46±0.43、13.84±0.87、7.26±0.57、7.73±0.46,各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=287.658,P<0.05);B 組較A、C和D 組明顯增加(P<0.05),A、C 和D 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡細(xì)胞主要見于初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞,見圖1。

    2.3 各組大鼠LH 和睪酮水平比較 B 組和D 組大鼠血清LH和睪酮水平較A組顯著降低(P<0.05),C組大鼠血清LH 和睪酮水平與A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但較B組升高(P<0.05)。D組大鼠血清LH水平與B組和C組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D組睪酮水平高于B 組(P<0.05),與C 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

    2.4 各組大鼠附睪精子參數(shù)比較 與A 組比較,B組大鼠附睪精子計(jì)數(shù)和活力均降低,而異常形態(tài)比例升高(P<0.05);與B組比較,C組和D組大鼠附睪精子計(jì)數(shù)和活力均增加,而異常形態(tài)降低(P<0.05);D組除大鼠附睪精子緩慢前進(jìn)比例低于C組、不動比例高于C 組外,其余參數(shù)與C 組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

    Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)和Johnsen評分比較 (n=8,±s)

    Tab.1 Comparison of germ cell count and Johnsen scores between four groups表1 各組生精細(xì)胞計(jì)數(shù)和Johnsen評分比較 (n=8,±s)

    *P<0.05;a與A組比較,b與B組比較,P<0.05

    組別A組B組C組D組F生精細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè))精原細(xì)胞11.37±0.54 9.81±0.35a 11.53±0.57b 10.14±0.46b 25.253*初級精母細(xì)胞23.36±0.38 15.02±0.55a 21.53±0.79b 20.15±0.64b 397.911*次級精母細(xì)胞35.26±0.53 18.63±0.68a 33.54±0.97b 27.38±1.03ab 659.061*精子細(xì)胞121.37±0.95 95.57±2.28a 118.54±1.36b 109.73±2.29ab 326.291*精子83.86±3.17 67.56±1.85a 82.56±1.67b 79.14±2.76b 73.818*Johnsen評分(分)9.54±0.07 8.36±0.18a 9.34±0.06b 9.06±0.07ab 185.917*

    Fig.1 Immunostaining of seminiferous tubules(TUNEL,×400)圖1 生精小管的免疫染色(TUNEL,×400)

    Fig.2 Effects of nicotine and melatonin on serum testosterone and LH levels圖2 尼古丁和褪黑素對大鼠血清LH和睪酮的影響

    Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素對附睪精子參數(shù)的影響 (n=8,±s)

    Tab.2 Effects of nicotine and melatonin on epididymis sperm parameters表2 尼古丁和褪黑素對附睪精子參數(shù)的影響 (n=8,±s)

    *P<0.05;a與A組比較,b與B組比較,c與C組比較,P<0.05

    組別A組B組C組D組F計(jì)數(shù)(×106/mL)32.53±1.47 23.45±0.76a 33.09±0.87b 29.83±0.81b 150.877*快速前進(jìn)(%)10.14±0.16 2.40±0.23a 12.53±0.16b 8.63±0.07b 5 474.09*緩慢前進(jìn)(%)38.45±2.17 30.24±2.84a 44.26±2.27b 35.42±2.56bc 44.914*不動(%)15.13±0.26 30.43±0.45a 10.52±2.47b 18.63±2.96abc 153.115*總活力(%)63.96±1.25 41.08±1.36a 67.64±1.95b 63.76±2.67b 329.514*異常形態(tài)(%)27.54±1.17 45.54±0.86a 25.86±0.58b 29.65±1.06b 735.802*

    2.5 各組大鼠精子染色質(zhì)完整性比較 與A 組比較,B組光暈精子比例顯著降低,DNA碎片指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與B 組比較,C 組和D 組光暈精子比例均升高,DNA碎片指數(shù)均降低(P<0.05)。D組光暈精子比例與C 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,DNA 碎片指數(shù)較C組升高(P<0.05),見表3。

    Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素對雄性大鼠精子染色質(zhì)完整性影響(n=8,±s)

    Tab.3 Effects of nicotine and melatonin on germ cell parameters and sperm chromatin integrity in four groups of rats表3 尼古丁和褪黑素對雄性大鼠精子染色質(zhì)完整性影響(n=8,±s)

    *P<0.05;a與A組比較,b與B組比較,c與C組比較,P<0.05

    組別A組B組C組D組F光暈精子(%)73.26±1.02 55.87±1.26a 73.64±1.57b 62.51±2.08ab 255.419*DNA碎片指數(shù)(%)12.26±0.54 32.25±0.83a 10.56±0.75b 20.27±0.85bc 1382.947*

    2.6 相關(guān)性分析 DNA碎片指數(shù)與血清睪酮水平、LH 水平和精子總活力呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.894、-0.763、-0.786,均P<0.05),與生殖細(xì)胞凋亡、精子異常形態(tài)呈正相關(guān)(r分別為0.782、0.837,均P<0.05)。

    3 討論

    尼古丁為3α-羥基類固醇脫氫酶抑制劑,在睪酮代謝及前列腺中雄激素變化等方面發(fā)揮重要作用[3]。以往研究表明,尼古丁可通過降低精子數(shù)量、形態(tài)、活力和睪丸質(zhì)量從而在不孕癥中發(fā)揮作用[11]。本研究對成年雄性大鼠腹腔注射尼古丁,尼古丁劑量為1 mg/kg,相當(dāng)于成人每天抽20支煙的血清尼古丁水平[6]。注射30 d后,大鼠精子發(fā)生、生殖細(xì)胞凋亡、精子參數(shù)和精子染色質(zhì)完整性均發(fā)生變化。上述效應(yīng)的可能原因是,尼古丁可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而抑制垂體促性腺激素釋放[11];而垂體促性腺激素變化又會引起睪丸精子發(fā)生和類固醇生成改變。

    精子發(fā)生是一種激素調(diào)節(jié)過程,特別是睪酮和促性腺激素,如卵泡刺激素和LH[12]。本研究結(jié)果顯示,尼古丁處理大鼠血清睪酮和LH 水平顯著降低。睪酮是精子發(fā)生啟始及維持的關(guān)鍵激素。LH 是由垂體分泌的,影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞并刺激其分泌睪酮。因此,LH水平降低后,睪酮水平也相應(yīng)降低,本研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。另外,本研究結(jié)果顯示,尼古丁處理后大鼠生精細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少,生精小管中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增多,這可能與尼古丁自身毒性以及睪酮和LH水平降低有關(guān);也可能與尼古丁處理后大鼠體內(nèi)氧化劑,如過氧化氫水平較高有關(guān)。目前已經(jīng)證明,尼古丁可減少睪丸抗氧化水平,并增加睪丸脂質(zhì)過氧化作用[5]。

    另外,本研究對精子染色質(zhì)完整性進(jìn)行了評估,以往研究僅通過精子參數(shù)評價(jià)男性生育狀況是不全面的[12]。精子DNA損傷程度與生育率降低相關(guān)[12];而且氧化應(yīng)激在單鏈和雙鏈DNA 斷裂中發(fā)揮重要作用[13]。Condorelli等[14]研究指出,尼古丁通過降低精子染色質(zhì)DNA完整性使精子活力和數(shù)量減少,并呈劑量和時(shí)間依賴性。有研究報(bào)道,精子活力和精子DNA 損傷也存在顯著的負(fù)相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,尼古丁可使精子形態(tài)異常及精子DNA斷裂增加;且DNA碎片指數(shù)與血清睪酮水平、LH水平和精子總活力呈負(fù)相關(guān),與以往研究結(jié)果基本一致。

    褪黑素是一種主要由松果體和其他器官合成的激素,如視網(wǎng)膜及淚腺。睪丸組織中褪黑素濃度與身體其他組織中類似[12]。研究表明,褪黑素具有抗氧化和捕獲自由基的能力[12]。體外研究表明,褪黑素也可改善化療小鼠精子發(fā)生和精子參數(shù)[16],褪黑素處理可提高精液質(zhì)量[17]。上述研究提示褪黑素對精子具有保護(hù)作用。本研究中褪黑素劑量為10 mg/kg,與文獻(xiàn)[2]中的劑量相同,結(jié)果顯示,褪黑素可改善尼古丁處理大鼠精子發(fā)生和精子參數(shù),可能與褪黑素的抗凋亡和抗氧化作用有關(guān)。褪黑素也可影響下丘腦-垂體-性腺軸和調(diào)節(jié)性激素分泌,如雌激素、睪酮和LH。本研究中褪黑素也可顯著提高睪酮和LH水平,并改善DNA碎片指數(shù),提示可能與褪黑素對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的直接作用有關(guān)。此外,褪黑素也可改善尼古丁處理大鼠精子染色質(zhì)完整性,提示精液中褪黑素可能與睪酮和抗氧化酶之間存在關(guān)聯(lián)[18]。

    綜上所述,褪黑素可通過減少生殖細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)睪酮水平改善尼古丁處理大鼠精子發(fā)生數(shù)量、質(zhì)量和精子染色質(zhì)完整性,但其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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