針刺預處理“極泉”與“內關”穴對房顫大鼠房顫持續(xù)時間和Cx40蛋白及mRNA表達的影響

王 桓，程 凱，任 杰，李昱頡，游 敏，吳嬌娟，林 怡，彭 超，古春凌，楊守親

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

腧穴特異性是指腧穴相對于他穴或非穴所具有的形態(tài)結構，從而反映疾病及治療效應上的相對特異性，是當代針灸界研究的方向與熱點，本實驗主要選擇極泉和內關兩穴進行研究?！额惤洝分杏涊d:“手少陰，心經也；手厥陰，心包絡經也；經雖分二，藏實一原；凡治病者，但治包絡之腧，即所以治心也，故少陰一經，所以獨無腧焉?！?從所主病候來講，心包經和心經都常用于治療心、胸和本經循行部位病癥等，為治療心臟疾病的高頻經脈，均可作為治療心系疾病的首選。內關穴作為治療心血管類疾病療效最為突出的穴位之一，據古代文獻記載，已成為心包經中使用頻率最高的穴位[1]，而對心經上腧穴治療心系疾病的研究卻相對較少。極泉穴為心經脈氣所發(fā)，《外臺秘要》載:其“心痛, 渴而欲飲，為臂厥，是主心所生病者”，可作為心經的代表穴位。心房顫動(Atrial fibriilation，Af)是最常見的心律失常之一，因此本實驗借助陣發(fā)性房顫大鼠模型，采用針刺預處理雙側“極泉”穴，與“內關”穴治療后的房顫持續(xù)時間進行對比，同時探討“內關”和“極泉”穴對房顫結構重構的作用機制，以此為兩穴的腧穴特異性研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

體質量180～200 g的雄性清潔級健康Wistar大鼠40只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。實驗前于北京中醫(yī)藥大學實驗室(恒溫恒濕SPF級)適應性喂養(yǎng)1周，每籠6～8只分籠飼養(yǎng)，自由進食進水。

1.2 試劑

氯化鈉注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司，C18060606)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，30037517)；氯化乙酰膽堿(Ach，Bioruler，RH32383-5g)；無水氯化鈣(Calcium chloride anhydrous，Bioruler，RH45167-25G)；Cx40(Abcam，ab183648)；Marker(Bio-rad，161-0374)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2301)。

1.3 儀器

無菌針灸針(蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司，0.20 mm×13 mm)；哺乳動物類手術器械一套；BL-420S生物信號采集與分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。蛋白檢測實驗儀器：穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(Bio-Rad，Powerpac HQ)；垂直電泳槽(Bio-Rad，MP3)；半干轉電轉印儀(Bio-Rad，Trans-Blot SD)；計算機圖像分析儀(Image-Pro Plus Analysis Soft ware)；常溫高速離心機(eppendorf，5417C)；4℃低溫高速離心機(Thermo，MR 23i)；紫外分光光度計(eppendorf,Biophotometer)；微量加樣器(eppendorf Research plus)。Real time PCR實驗儀器：Real-Time PCR儀(ABI 7500)；數碼凝膠成像系統(tǒng)(BINTA)。

2 方法

2.1 實驗分組

將體質量均衡的大鼠用隨機數字表法進行隨機分組，分成正常組、模型組、內關組和極泉組共4組，每組10只大鼠。

2.2 腧穴定位

腧穴定位根據大鼠的形態(tài)和解剖結構特點，參照《實驗針灸學》穴位標準定位如下。內關：穴位位于前肢內側，距腕關節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間；極泉：穴位位于腋窩頂點，腋動脈搏動處。

2.3 模型制備

采用陰莖經脈注射Ach 66 μg/mL+CaCl210 mg/mL混合液(1 mL/kg，當日新鮮制備)進行造模，以心電圖出現(xiàn)典型Af改變者為造模成功，剔除造模前及造模過程中心電圖已出現(xiàn)異常、注射中死亡或造模未成功的大鼠。正常組經陰莖經脈注射生理鹽水(1 mL/kg)，模型組經陰莖經脈注射造模液，內關組和極泉組在進行針刺預處理后經陰莖經脈注射造模液。上述每組各10只大鼠，每日注射1次，連續(xù)7天進行造模。

2.4 處理方法

隨機稱重各組大鼠，后計算其造模液注射量并于當日新鮮配置。正常組：予捆綁20 min后麻醉，經陰莖經脈注射生理鹽水；模型組：予捆綁20 min后麻醉，經陰莖經脈注射造模液造模；內關組：以0.20 mm×13 mm規(guī)格無菌針灸針直刺雙側內關穴；極泉組：以0.20 mm×13 mm規(guī)格無菌針灸針直刺雙側極泉穴，以針柄可見輕顫為度。兩組針刺預處理組均行針1 min，以30 r/min輕微捻轉，10 min后行針第2次，共留針20 min，每日1次，共7天，針刺預處理結束后麻醉，經陰莖經脈注射CaCl2-Ach混合液進行造模。

2.5 大鼠房顫持續(xù)時間記錄

將處理結束后的大鼠以5 mL/kg腹腔注射7%水合氯醛進行麻醉，待大鼠昏迷將其仰臥位固定于桌面，用針形電極刺入已消毒的四肢，描記大鼠正常心電圖后(記錄標準肢體導聯(lián))見圖1，經陰莖靜脈以1 mL/kg注射CaCl2-Ach混合液。心電圖以P波消失且出現(xiàn)典型的f波為房顫發(fā)生標志，以f波消失、P波出現(xiàn)恢復竇性心律為房顫終止,見圖2，記錄每日房顫持續(xù)時間。

圖1 正常大鼠心電圖

圖2 造模后房顫大鼠心電圖

2.6 大鼠心房肌Cx40蛋白表達檢測

2.6.1 蛋白提取及定量 將心房肌組織從液氮取出，于預冷的研缽中快速研磨成粉末。將50 μL細胞裂解液加入預冷EP管，放入組織粉末，冰上孵育20 min后以4℃ 10 000 r/min離心10 min。將上清移至另一預冷的EP管中，BCA法測定蛋白含量后，將剩余蛋白樣品加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水中煮5 min。

2.6.2 Western blot實驗 ①配制10%SDS-PAGE分離膠溶液，加入5%濃縮膠,取40 μg 蛋白量的組織總蛋白樣品及蛋白質分子量Marker，按1∶4體積比加入5×樣品緩沖液，以1×樣品緩沖液配平上樣體積后，沸水浴5 min;②電泳初始電壓為80 V，待溴酚藍染料的前緣進入分離膠上緣后提高電壓至100 V，至溴酚藍泳出分離膠下緣結束;③采用半干電轉移儀進行蛋白質的電轉移，恒流30 mA，電轉90 min;④5%TBS-T脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min;⑤一抗孵育(稀釋比例1∶2 000);⑥二抗孵育(稀釋比例1∶2 000);⑦PVDF膜置ECL混合液中于室溫下振蕩溫育5 min，置于X光片盒中感光顯影;⑧用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進行灰度分析。

2.7 大鼠心房肌Cx40 mRNA表達檢測

2.7.1 總RNA提取 目的基因RT-PCR的檢測引物見表1。

表1 引物序列

2.7.2 反轉錄 將RNA 5 μL、Oligo(dT)2 μL、dd H2O(DEPC處理)4.5 μL加入離心管中，先42℃孵育60 min，后70℃孵育10 min。

2.7.3 RT-PCR 將cDNA 2 μL、引物1(10 pmol/μL)0.5 μL、引物2(10 pmol/μL)0.5 μL、SYBR mix 10 μL、dd H2O 7 μL同所得的cDNA一起加入離心管中混勻。Real-Time PCR程序設置為94℃預變性10 min，(94℃ 15 s，60℃ 60 s)×35個循環(huán)，72℃ 10 min。

2.7.4 PCR產物分析 用相對定量2-ΔΔCT分析法計算各個樣本目的基因的表達變化。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠房顫持續(xù)時間比較

大鼠連續(xù)注射造模液7天后，與正常組比較，模型組大鼠房顫持續(xù)時間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較，內關組、極泉組大鼠的房顫持續(xù)時間均縮短(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 造模7天后各組大鼠房顫時間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖3 造模7天后各組大鼠房顫時間比較圖

3.2 各組大鼠心房肌Cx40蛋白表達結果比較

與正常組比較，Cx40蛋白在模型組表達增高(P<0.01);與模型組比較，大鼠經過1周針刺預處理后，Cx40蛋白表達水平在內關組、極泉組均下調(P<0.01)。見表3、圖4～5。

表3 各組大鼠心房肌Cx40蛋白相對表達量比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖4 各組大鼠心房肌Cx40蛋白相對表達量比較圖(n=3)

圖5 Western blot檢測各組大鼠心房肌Cx40蛋白條帶

3.3 各組大鼠心房肌Cx40 mRNA表達結果比較

各組大鼠心房肌Cx40 mRNA相對表達量見圖6，結果顯示，正常組、模型組、經過1周針刺預處理的內關組和極泉組，各組間無顯著差異。

圖6 各組大鼠心房肌Cx40 mRNA相對表達量比較

4 討論

房顫是最常見的心律失常之一，幾乎可在所有的器質性心臟病中發(fā)生。目前認為,房顫是多種機制共同作用的結果，其中以Wijffels在1995年提出的“房顫引發(fā)房顫”的心房電重構和“第二因子學說”心房結構重構為參與房顫過程的主導理論[2]。心房的結構重構主要表現(xiàn)在房顫過程中心房肌的纖維化影響了心房肌縫隙連接蛋白(connexin，Cx)的表達量和分布，造成細胞間電信號傳導通路受阻，房顫易感性增高[3]。相關研究證明，Cx40蛋白表達量和Cx40 mRNA轉錄水平的上調是心房結構重構過程中的主要參與者，可促進折返的發(fā)生[4-5]。

本實驗結果顯示，經過1周造模后，模型組的Cx40蛋白表達量較正常組明顯升高，說明房顫的發(fā)生機制確與縫隙連接蛋白Cx40的表達水平有關；與模型組比較，內關組和極泉組的Cx40蛋白表達量下調，體現(xiàn)了針刺預處理對房顫發(fā)生的拮抗作用。但在對Cx40 mRNA轉錄水平的探究中，各組結果并無顯著差異，說明房顫大鼠Cx40蛋白在基因層面的表達變化不明顯。從房顫持續(xù)時間的比較來講，大鼠連續(xù)注射造模液1周后，與正常組比較，模型組大鼠房顫持續(xù)時間顯著延長，說明造模成功；與模型組比較，內關組、極泉組大鼠的房顫持續(xù)時間均縮短，說明極泉穴與內關穴在房顫的發(fā)生中均起到防治作用。值得一提的是，本實驗對常用的經尾靜脈注射Ach 66μg/mL+CaCl210 mg/mL混合液誘發(fā)大鼠房顫的造模方式[6]進行了操作上的改善，在造模液配制方法及劑量不變的情況下改經陰莖經脈注射后，造模效果與原方案無差異，操作流程上相對更簡便。

臨床及實驗研究表明，針刺療法在房顫的治療中療效顯著，相對于單純的藥物治療如胺碘酮更優(yōu)[7-8]，被患者普遍認可接受。本實驗所采用的針刺預處理手段，即在發(fā)病前施用針刺治療，體現(xiàn)了中醫(yī)“治未病”的預防醫(yī)學理念?，F(xiàn)代臨床及實驗研究均證實，預先針刺可以達到阻抑隨后疾病對機體組織器官損傷的作用[9-11]。而在心律失常領域中，對于針刺預治療房顫的療效迄今鮮有人涉足，房顫的發(fā)生往往突發(fā)無征兆性，因此本實驗的設計對于充分發(fā)揮針刺在防治房顫中的作用將大有裨益。且針灸治療房顫具有價格低廉、操作安全簡捷等優(yōu)點，有重要的臨床應用價值，值得被進一步推廣。

內關穴為手厥陰經之絡穴，又是八脈交會穴之一，根據《針灸甲乙經》描述“心系實則心痛,虛則為煩心,取之兩筋間；心憚憚而善驚恐，心悲，內關主之”，主治心痛、心悸，有寧心、安神、定悸。亦有大量現(xiàn)代臨床和實驗研究證明，內關穴在降低心率、恢復節(jié)律方面有正向調節(jié)作用，在治療房顫時有較顯著療效[12-14]。而選擇心經的極泉穴與心包經的內關穴進行療效對比，一方面是基于“經脈所過，主治所及”“寧失其穴，勿失其經”的針灸基礎理論；一方面則是欲從極泉穴的近治作用與內關穴的遠治作用角度進行腧穴特異性的比對分析。相對內關穴而言，對極泉穴的研究在古籍經典及現(xiàn)代實驗中都較少，與此穴居腋窩處不便于臨床進行針刺治療或許有關。然《靈樞·邪客》曰:“人有八虛……以候五藏……肺心有邪，其氣留于兩肘；肝有邪，其氣留于兩腋……凡此八虛者，皆機關之室，真氣之所過，血絡之所游?！睒O泉位于腋下，是八虛之一，為氣血運行的重要樞紐，其療效不可忽視。本實驗結果表明，極泉穴防治房顫的效果與內關穴相當，且臨床已證實極泉穴具有改善心肌供血量[15]、緩解急性心絞痛[16]等作用，因而極泉穴治療心系疾病的作用機制有待現(xiàn)代醫(yī)學做出進一步的研究。

基于對內關與極泉穴的療效分析，可以對心包經和心經的關系做進一步的探討。從經脈循行的角度看，兩者的循行路線有著驚人的相似性；從兩經上的穴位來看，數量相同，均為9穴；同節(jié)段穴位主治相近，如上臂近肩部手少陰經的極泉與手厥陰經的天泉均擅長治療心痛；如前臂腕部手少陰經的神門與手厥陰經的大陵均擅長治療失眠怔忡等神志問題。因此可以推測，心經和心包經，實為一經[17]。古代文獻中有相關理論支撐，如六朝時《產經》所載“手心主脈圖”中仍稱“心主者，內屬于心”,且《太素·本輸》卷十一有言:“心出中沖……溜于勞宮……注于大陵……行于間使……入于曲澤……手心主經也”，其中的中沖、勞宮、大陵、間使和曲澤現(xiàn)為心包經五腧穴；現(xiàn)代研究亦表明，心經與心包經相關區(qū)域感覺神經元的節(jié)段分布心臟感覺神經元節(jié)段分布有重疊現(xiàn)象[18]，結合本實驗結果，也許可以為心經和心包經同屬一經的猜想提供論證依據。

綜上，本實驗結果表明，針刺預處理極“泉穴”與“內關”穴在縮短房顫持續(xù)時間的效果相當，其機制可能與下調房顫大鼠心房肌心房縫隙連接蛋白Cx40的表達有關，但并未影響到基因層面的表達。本實驗旨在為房顫的臨床防治手段提供針刺治療新思路，并期未來對極泉穴的腧穴特異性、心經及心包經兩經從屬關系的研究有進一步深入的探索。