一株可提升豆醬風(fēng)味乳酸菌的篩選、鑒定及應(yīng)用

周其洋，侯 杰

（佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528000）

豆醬為我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，具有風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富、口感鮮咸協(xié)調(diào)，柔和而回味悠長，易于消化吸收的特點(diǎn)，深受中外消費(fèi)者的青睞[2]。隨著改革開放的進(jìn)程，米曲霉（Aspergillus oryzae）、醬油曲霉（Aspergillus sojae）、酵母菌等純菌種應(yīng)用技術(shù)在傳統(tǒng)釀造中得到了廣泛應(yīng)用[2]。但是目前絕大多數(shù)的廠家還是采取的半開放式釀造工藝[3]，不可避免的會接入天然釀造微生物。因此，實(shí)際上的釀造過程仍然屬于多菌種共酵的工藝[4-6]。在豆醬制曲過程中，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[7]的生長會消耗原料中的碳水化合物、有機(jī)酸和氨基酸，產(chǎn)生不良?xì)馕叮€會產(chǎn)生抗真菌性物質(zhì)且迅速消耗氧氣，從而抑制曲霉生長，降低曲霉的蛋白酶活，嚴(yán)重影響后續(xù)發(fā)酵質(zhì)量。同時，芽孢桿菌還是造成醬、醬油產(chǎn)品變質(zhì)的主要微生物。乳酸菌能夠產(chǎn)生一些抑菌成分[8]，對微生物起到抑制作用[9-11]，比如說Nisin，是一種由34個氨基酸組成的多肽類物質(zhì)[12]，目前已經(jīng)作為一種天然防腐劑被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)之中，對多種革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑菌作用[13]。另外，研究表明[14-15]，乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）等乳酸菌均能產(chǎn)生成分不同、性質(zhì)各異的抑菌成分。目前，對于豆醬釀造過程中的微生物菌群組成研究比較多，而對于不同微生物間的拮抗調(diào)控關(guān)系研究比較少，更缺乏應(yīng)用方面的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用豆醬作為培養(yǎng)基。研究并加以富集、篩選、鑒定及強(qiáng)化對豆醬風(fēng)味有明顯提升的乳酸菌，對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等有害微生物進(jìn)行拮抗調(diào)控，不僅對于促進(jìn)曲霉生長、提升成曲酶活、改善發(fā)酵程度有重要貢獻(xiàn)[16-19]，還能夠改善產(chǎn)品煮制階段的工藝設(shè)計(jì)，降低產(chǎn)品煮制殺菌加熱強(qiáng)度，節(jié)約能源消耗，提升產(chǎn)品感官風(fēng)味質(zhì)量[20]，對于實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌種

豆醬：佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司發(fā)酵曬場；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.042：佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司菌種保藏中心；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YB1、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YB2：佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司實(shí)驗(yàn)室篩選。

1.1.2 化學(xué)試劑

CaCO3（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大豆、面粉、精制食用鹽（均為食品級）：佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；S-18K組織勻漿器：常州市金壇晨陽電子儀器廠；2K15離心機(jī)：德國Sigma公司；ZHPW-70臺式振蕩培養(yǎng)箱：天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目標(biāo)豆醬收集

選取氨基酸態(tài)氮含量＜0.50 g/100 g，總酸含量＞2.50 g/100 g的豆醬進(jìn)行感官鑒評，結(jié)果顯示口感酸味明顯、鮮味較弱、醬香風(fēng)味不顯著且有異味的發(fā)酵豆醬為劣質(zhì)豆醬。選取氨基酸態(tài)氮含量＞1.50 g/100 g，總酸含量＜1.30 g/100 g的豆醬進(jìn)行感官鑒評，結(jié)果顯示酸甜協(xié)調(diào)、鮮咸柔和、醬香突出純正的豆醬為優(yōu)質(zhì)豆醬。分析劣質(zhì)豆醬和優(yōu)質(zhì)豆醬中的芽孢桿菌和乳酸菌的含量。

1.3.2 特征微生物培養(yǎng)及驗(yàn)證

有害微生物菌群培養(yǎng)及驗(yàn)證：將LB培養(yǎng)基140 g，發(fā)酵豆醬60 g勻漿，加入食鹽10 g，121℃滅菌20 min。冷卻至室溫后接入2 g劣質(zhì)豆醬，于37.0℃條件下150 r/min搖瓶培養(yǎng)40 h，菌種成熟。取成熟菌液按1%（V/V）接種量，按該培養(yǎng)方案傳代3次，得有害微生物菌群培養(yǎng)液。

將有害微生物菌群培養(yǎng)液于10 000×g條件下離心10 min，收集菌體。將1 g離心收集的菌體添加至1 000 g豆醬中進(jìn)行30℃恒溫靜置發(fā)酵。發(fā)酵60 d后取出豆醬測定其總酸、氨基酸態(tài)氮含量，并進(jìn)行感官鑒評。

有益微生物菌群培養(yǎng)及驗(yàn)證：將MRS肉湯培養(yǎng)基140 g，發(fā)酵豆醬60 g勻漿，加入食鹽10 g，121℃滅菌15 min。冷卻至室溫后接入2 g優(yōu)質(zhì)豆醬，于35.0℃條件下靜置培養(yǎng)40 h，菌種成熟。取成熟菌液按1%（V/V）接種量，按該培養(yǎng)方案傳代3次，得有益微生物菌群培養(yǎng)液。

將有益微生物菌群培養(yǎng)液于10 000×g條件下離心10 min，收集菌體。將1 g離心收集的菌體添加至1 000 g豆醬中進(jìn)行30℃恒溫靜置發(fā)酵。發(fā)酵60 d后取出豆醬測定其總酸、氨基酸態(tài)氮含量，并進(jìn)行感官鑒評。

1.3.3 目標(biāo)菌株初篩

將有害微生物菌群培養(yǎng)液稀釋10 000倍后，取100μL涂布至LB平板。37.0℃培養(yǎng)至菌落直徑約1 mm時，進(jìn)行3次劃線純化。純化后的單菌株接種至含鹽量5%的LB培養(yǎng)基，37.0 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)40 h。菌種成熟后10 000×g條件下離心10 min，取1 g菌體添加至1 000 g豆醬進(jìn)行發(fā)酵。選能造成豆醬總酸升高至2.5 g/100 g，且豆醬產(chǎn)生異味的菌株標(biāo)定為有害菌株，以YB命名。

通常認(rèn)為能對其他微生物形成抑制的乳酸菌都有一定的產(chǎn)酸能力，因此，采用CaCO3水解圈直徑作為初篩評價指標(biāo)。有益微生物菌群培養(yǎng)液稀釋10 000倍后，取100μL加至平板，將含5%鹽及0.5%CaCO3的MRS培養(yǎng)基傾注至平板內(nèi)。35.0℃培養(yǎng)至菌落直徑約1 mm時，進(jìn)行3次劃線純化。純化后的單菌株接種至含鹽量10%的MRS肉湯，35.0℃培養(yǎng)40 h，獲得初篩乳酸菌[21]，以ZF命名。

1.3.4 目標(biāo)菌株復(fù)篩

由于篩選能對豆醬風(fēng)味形成破壞的菌株相對容易，但是篩選能對豆醬產(chǎn)生明顯品質(zhì)提升的乳酸菌則相對困難，且工作量極大。因此，將已獲得的芽孢桿菌YB菌株作為驗(yàn)證手段，若該菌株能夠?qū)B菌株形成抑制的，則說明有一定的抑菌能力，可能對豆醬發(fā)酵形成正向作用，以此來促進(jìn)目標(biāo)乳酸菌的篩選。采用杯碟法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)篩選，操作如下：采用1%的K2HPO4的改良LB培養(yǎng)基作為指示菌生長培養(yǎng)基，采用兩株有害微生物單菌（YB1、YB2來源于1.3.3篩選所得）作為指示菌，將15 mL指示菌生長培養(yǎng)基倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，加入0.2 mL指示菌懸液，涂布均勻，待干燥后用無菌鑷子放置牛津杯，靜置20 min后取發(fā)酵液0.1 mL加入牛津杯內(nèi)。40℃培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑，挑選抑菌圈直徑＞1.30 cm的菌懸液對應(yīng)的菌株作為復(fù)篩目標(biāo)菌株。

1.3.5 菌種鑒定

提取優(yōu)良菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。對檢測所得的基因序列進(jìn)行比對，按照基因片段相識度辨別目標(biāo)菌株的種屬關(guān)系。

1.3.6 菌種應(yīng)用驗(yàn)證

將篩選得到的有害菌株單菌和有益菌株單菌擴(kuò)培后，成熟菌種10 000×g條件下離心10 min取沉淀。將1 g菌體沉淀混入1 000 g豆醬進(jìn)行30℃恒溫發(fā)酵。對成熟豆醬進(jìn)行總酸、氨基酸態(tài)氮含量的檢測和感官鑒評。

1.3.7 分析檢測

總酸含量的測定采用國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；氨基酸態(tài)氮含量的測定采用國標(biāo)GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》；枯草芽孢桿菌的檢測采用國家出入境檢驗(yàn)檢疫行標(biāo)SN/T 2728—2010《枯草芽孢桿菌檢測鑒定方法》；乳酸菌的檢測采用國標(biāo)GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》。樣品的感官鑒評由30位有1年以上豆醬鑒評經(jīng)驗(yàn)的人員從色澤、口感及香氣方面采用5分制評分法進(jìn)行鑒評。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)豆醬收集

對豆醬樣品進(jìn)行理化檢測及感官鑒評，結(jié)果如表1所示。

表1 不同豆醬樣品理化分析和感官鑒評結(jié)果Table 1 Physical and chemical analysis and sensory evaluation results of different soybean paste samples

由表1可知，1號樣品和2號樣品在風(fēng)味感官上較低，綜合評分均值2.3～2.5分，其酸味較重，鮮味弱而微有異味。而3號樣和4號樣在風(fēng)味感官上較優(yōu)，綜合評分均值4.5～4.6分，其鮮咸協(xié)調(diào)，醬香濃郁。分析原因是由于1號和2號豆醬中枯草芽孢桿菌大量生長，爭奪了豆醬發(fā)酵過程中的營養(yǎng)資源，同時當(dāng)枯草芽孢桿菌數(shù)量增殖到1.0×106CFU/g后，會抑制豆醬發(fā)酵關(guān)鍵微生物米曲霉的生長，導(dǎo)致米曲霉產(chǎn)生的以中性蛋白酶為代表的酶活力明顯下降，使豆醬中的蛋白質(zhì)分解明顯偏離正常水平，使其氨基酸態(tài)氮含量明顯低于較優(yōu)的3號和4號豆醬。微生物體系、酶系的失衡，導(dǎo)致產(chǎn)酸微生物的生長。造成豆醬總酸高，氨基酸態(tài)氮低的情況，形成了豆醬酸而不鮮的口感。而芽孢菌的生長會產(chǎn)生異味，使豆醬的氣味較差。而乳酸菌的生產(chǎn)，由于其菌體總量并不高，并沒有因?yàn)槠涫钱a(chǎn)酸菌而導(dǎo)致總酸升高。同時乳酸菌通過其生長活動抑制了芽孢桿菌等有害菌的生長，使豆醬發(fā)酵的微生物體系達(dá)到正常水平。

綜上所述，是某種產(chǎn)酸的乳酸菌對以芽孢桿菌為代表的有害菌形成抑制，使豆醬發(fā)酵微生物體系向形成良好風(fēng)味的方向轉(zhuǎn)變。因此，設(shè)計(jì)一種以CaCO3為初篩模型，以芽孢桿菌為復(fù)篩方案的篩選模型，來篩選目標(biāo)乳酸菌。

2.2 特征微生物培養(yǎng)及驗(yàn)證

將有害及有益的微生物菌群進(jìn)行富集后，采用LB固體培養(yǎng)基和MRS平板檢測其中的芽孢桿菌數(shù)和乳酸菌含量?？莶菅挎邨U菌的數(shù)量從初始的1.0×104CFU/g上升至6.8×107CFU/g。乳酸菌數(shù)從初始的1.0×104CFU/g上升至培養(yǎng)后的3.5×108CFU/g。將富集培養(yǎng)液回添至豆醬發(fā)酵體系中后，考察富集菌株對其風(fēng)味的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 添加富集菌種對發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of adding enriched strains on fermentation

由圖1可知，目標(biāo)豆醬（優(yōu)質(zhì)豆醬和劣質(zhì)豆醬）擴(kuò)大培養(yǎng)傳代3次后，離心收集菌體，排除原有豆醬中的風(fēng)味成分對豆醬的添加菌株產(chǎn)生的影響。通過添加試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：添加了有害微生物菌液離心菌體的豆醬表現(xiàn)出品質(zhì)劣化的特性，添加了有益微生物菌液離心菌體的豆醬表現(xiàn)出豆醬品質(zhì)更優(yōu)良的特性。且該特性流加至其他空白豆醬具有傳染性，說明是某些微生物對豆醬的品質(zhì)形成了顯著影響?？诟斜憩F(xiàn)為添加有益微生物菌群豆醬產(chǎn)品較未添加目標(biāo)菌種的發(fā)酵豆醬香氣更加濃郁、協(xié)調(diào)?？诟懈訁f(xié)調(diào)，表現(xiàn)出酸、甜、咸、鮮糅合在一起的豐富感，而未添加富集菌種的發(fā)酵醬則口感較為平淡。分析原因可能是由于有益的乳酸菌得到快速的增殖，對有害的芽孢桿菌形成了競爭性抑制。同時乳酸菌可能通過產(chǎn)生的乳酸也有效抑制了其他雜菌的生長。如果從豆醬體系中獲得能明顯改善豆醬品質(zhì)的純種乳酸菌菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后添加至豆醬發(fā)酵中，則可以整體提升豆醬品質(zhì)。

2.3 目標(biāo)菌株初篩

從富集的有害微生物菌液中，共計(jì)篩選到32株可以造成不良影響的芽孢桿菌。其中菌株YB1和YB2添加后發(fā)酵體系產(chǎn)酸及氣味變臭最明顯。于是將對這兩株菌的抑菌效果作為目標(biāo)乳酸菌篩選的驗(yàn)證條件。通過對有益微生物菌液進(jìn)行分離，共挑選獲得了59株菌，培養(yǎng)24 h時可在含CaCO3的MRS培養(yǎng)基形成2 mm以上水解圈。對59株初篩乳酸菌進(jìn)行傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證，觀察3次傳代過程中菌種的生長情況及水解圈形成情況，挑選其中生長比較快，水解圈較大（＞2 mm）的9株菌為初篩菌株。

2.4 目標(biāo)菌種株復(fù)篩

9株初篩菌對兩株枯草芽孢桿菌YB1和YB2的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，9株初篩菌對兩株枯草芽孢桿菌YB1和YB2都具有一定抑菌活性，其抑菌圈直徑在1.30～1.60 cm之間。其中菌株ZF559和ZF757的抑菌圈直徑在1.50～1.60 cm之間，較其他菌株更強(qiáng)，且對芽孢桿菌YB1和YB2的抑菌能力相似，確定菌株ZF559和ZF757為目標(biāo)菌株。

圖2 9株菌對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of 9 strains on Bacillus subtilis

2.5 目標(biāo)菌株鑒定

對菌株ZF559進(jìn)行16S rDNA測序鑒定，序列如下：

CTTCCGTTAATTGATTATGACGTGCTTGCACTGA ATGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGGACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGCAGGGGA TAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAG AGAAAACCGCCTGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCT GCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATG CGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATG GAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCT CGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAG AGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAA AGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCG TAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTG AAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAA CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAAC TCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAA GAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAA CTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACA GGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGAT GATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTG CTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGT ACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATC TTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGG GACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTCAGTTGG GCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACA ACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTT AAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTC GCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGAT CAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA CACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACC

對菌株ZF757進(jìn)行16S rDNA測序鑒定，序列如下：

ATGCAGTCGAACGCAATCTTTTAACAATGAGTG CTTGCACTCAGCGTTTTAAGTGCGAGTGGCGAACGG GTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCGAAAGTGGG GGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATCA ACCGACTGACCGCCTGGTCGGTCGGGCAAAGACGG CGTCAGCTGTCGCTTTTGGATGAGCCCGCGGCGTAT TAACTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGTGAT GATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACAT TGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCT GATGGAGCAACGCCGCGTGTATGAAGAAGGTCTTCG GATCGTAAAATACTGTTGTCAGAGAAGAACACGGGA TAAAGTAACTATTGTTCCGCTGACGGTATCTGACCA GCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTG GGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGA TGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATTG GAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTG GAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAT GGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCT GTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGGAGCG AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAA CGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTC GGTGCCGCAGTTAACGCACTAAGCATTCCGCCTGGG GAGTACGATCGCAAGATTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCTTTTGACCATCTGAGAGATCAGAATTTCCCTT CGGGGACAAAATGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTC AGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCACAA CGAGCGCAACCCTTATTGTCAGTTGCCAGCATTGAG TTGGGCACTCTGGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGG AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCC TTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGA TACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTTAGCTAATC TCTGAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCA ACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCT TGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAA CACCCAAAGCCGGTGCGGTAACCATTTGGAGCCAGC CGTCTAAGGTGGGACAGATGA

對鑒定序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，菌株ZF559與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的同源性為99.9%，菌株ZF757與破布子乳酸桿菌（Lactobacillus tatum）的同源性為99.9%。衛(wèi)生部刊發(fā)的《可用于食品的菌種名單（衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)〔2010〕65號）》中明確規(guī)定乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）為可用于食品的微生物，而破布子乳桿菌未列入其中。說明菌株ZF559作為一株安全且可穩(wěn)定提升豆醬風(fēng)味的乳酸菌，可以用于實(shí)際豆醬制作。而菌株ZF757則缺乏明確的允許使用依據(jù)，不能用于實(shí)際生產(chǎn)。因此，選擇菌株ZF559進(jìn)行豆醬應(yīng)用試驗(yàn)。

2.6 菌種應(yīng)用驗(yàn)證

將菌株YB1、ZF559在含10%食鹽的培養(yǎng)基中擴(kuò)培后添加至豆醬體系中，發(fā)酵后指標(biāo)變化見表2。

表2 豆醬中添加菌株YB1及ZF559的應(yīng)用效果Table 2 Application effect of adding strain YB1 and ZF559 in soybean paste

由表2可知，通過在豆醬體系中添加0.1%乳酸菌ZF559至豆醬體系中，其總酸從1.42 g/100 g降低至1.31 g/100 g，下降了7.7%；氨基酸態(tài)氮從1.45 g/100 g上升至1.80 g/100 g，提升了24%；枯草芽孢桿菌數(shù)量從2.2×104CFU/g下降至1.2×103CFU/g，降低了94.54倍。特別是當(dāng)豆醬體系中有枯草芽孢桿菌時，引入同等數(shù)量級乳酸菌ZF559后，可以將總酸從2.55 g/100 g的降低至1.35 g/100 g，下降了47%，氨基酸態(tài)氮從0.51 g/100 g上升至1.76 g/100 g，提升245%。同時這種趨勢也表現(xiàn)在乳酸菌數(shù)和中性蛋白酶上，枯草芽孢桿菌會造成乳酸菌數(shù)量和中性蛋白酶活力下降。這說明枯草芽孢桿菌可以通過使豆醬中的酶活力下降，造成氨基酸態(tài)氮下降，同時會造成品質(zhì)的劣化。通過在豆醬中引入乳酸菌ZF559后，可以抑制枯草芽孢菌的生長，提升豆醬中的氨基酸態(tài)氮，降低總酸，同時通過抑制有害微生物的生長，避免不良?xì)馕?、口感的產(chǎn)生，使豆醬的整體風(fēng)味從3.8分上升至4.3分，提升13%。

3 結(jié)論

從豆醬發(fā)酵體系中篩選得到菌株ZF559，通過16S rDNA測序鑒定其是一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。該菌在10%以上的鹽分以及35℃的環(huán)境中可以快速生長。該耐鹽的乳酸片球菌加入豆醬發(fā)酵體系后，可以抑制枯草芽孢桿菌等微生物的生長，使米曲霉的生長及產(chǎn)酶能力更強(qiáng)。使豆醬總酸降低7.7%，氨基酸態(tài)氮提升24%，使枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的數(shù)量降低94.54%，顯著增強(qiáng)豆醬的風(fēng)味。