威寧豆醬中主酵菌株的分離與鑒定

張問平，黃曉潤，郭 婭，曾金興，黎忠杰，佟碩秋，吳擁軍*

（貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

豆醬是中國傳統(tǒng)的調味品，是經自然發(fā)酵而成的半流動狀態(tài)的發(fā)酵食品，也稱黃豆醬、黃醬或大豆醬[1]。中國是世界上最早發(fā)明醬制作方法的國家，制醬技術的起源可以追溯到公元前一千余年，《周禮》和《論語》中都有記載[2]。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬除了作為調味品之外，其含有異黃酮類、多酚類、大豆皂苷、類黑精、肽類、維生素等大量對人體有益的生理活性物質，具有較好的保健功能[3-6]。

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬采用開放式生產，空氣中各種微生物混入后共同生長，通過發(fā)酵、后熟等階段，形成了發(fā)酵豆醬特有的風味[7]。這些微生物主要包括霉菌、細菌和酵母菌，其中，霉菌起主要作用[8]。威寧豆醬也是經過特殊的工藝自然發(fā)酵而成，具有特殊的色、香、味、形，是當?shù)厝藗兩钪胁豢苫蛉钡恼{味品。其傳統(tǒng)工藝為：炒豆、磨豆、捏團、制曲發(fā)酵，加入輔料、后發(fā)酵。威寧豆醬傳統(tǒng)的生產多為家庭作坊式生產，生產工藝落后，發(fā)酵周期長，原料及設備利用率低，產品質量不穩(wěn)定，不能滿足市場需求。為了提高豆醬發(fā)酵風味品質，可以選擇人工接種純種發(fā)酵的方式進行發(fā)酵，這也是目前發(fā)酵食品研究中的熱點和主要趨勢。

目前，高秀芝等[9-13]采用多種方法對豆醬中微生物進行研究，并對豆醬發(fā)酵工藝進行研究，但是對威寧豆醬發(fā)酵的研究鮮見報道，關于威寧豆醬純種發(fā)酵的研究尚未見報道。因此，本研究從威寧豆醬中分離并鑒定主要的發(fā)酵菌株，分別將菌種應用在威寧豆醬純種發(fā)酵工藝上，以期為威寧豆醬的純種發(fā)酵提供優(yōu)良菌種，為威寧豆醬的發(fā)酵及工藝化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

威寧豆醬醬曲樣品：威寧地區(qū)；威寧豆醬成品：威寧地區(qū)農戶自釀。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然，121℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，瓊脂15 g，蒸餾水800 mL，pH自然，121℃滅菌20 min，臨用前加入0.03%鏈霉素稀釋液100 mL。

1.1.3 試劑

Mix、載體pMD 18-T、Hind III限制性核酸內切酶（15 U/μL）、EcoR I限制性核酸內切酶（15 U/μL）：寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

GZX-GF101-3-BS-II電熱鼓風恒溫干燥箱、DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；GR 60 DA高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；BX 53顯微鏡：日本Olympus公司；MB90水分測定儀：奧豪斯儀器（常州）有限公司；VITEK2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)：梅里埃診斷產品（上海）有限公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Universial Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

稱取5 g樣品于45 mL無菌生理鹽水中，室溫、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min，懸液用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋至10-8，取稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液100 μL分別涂布于PDA培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，將涂布好的PDA、馬丁氏培養(yǎng)基置于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h，LB培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h，觀察生長情況。挑取菌落形態(tài)不同的菌株純化3次，將純化后的菌種4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 威寧豆醬發(fā)酵工藝流程及操作要點

選豆→烘焙→磨豆→接種→主（前）發(fā)酵→加入輔料→后發(fā)酵→豆醬

操作要點：將黃豆在140℃條件下烘焙1.5 h，磨成細粉狀，通過60目篩，稱取50 g黃豆粉于500 mL錐形瓶中，121℃滅菌20 min，將前期分離純化的菌株分別制成菌懸液（1×107CFU/mL），以1%（V/V）的接種量接種于黃豆粉中，再以黃豆粉∶水=5∶4（g∶mL）的料水比加入無菌水，攪拌均勻。接種真菌的物料置于28℃發(fā)酵15 d，接種細菌的物料置于37℃發(fā)酵15 d。前發(fā)酵好的物料中加入輔料（辣椒粉、五香粉、食鹽），再以物料∶水=5∶3（g∶mL）加入無菌水，攪拌均勻，接種真菌的物料置于28℃、接種細菌的物料置于37℃各發(fā)酵3個月。

1.3.3 感官評價和主酵菌株篩選

采用10人品嘗小組綜合計分，參照國標GB/T 24399—2009《黃豆醬》對豆醬的色澤、氣味、滋味、體態(tài)進行感官評分，總分以100分記，具體評分標準見表1。以得分值較高者作為主酵菌株。采用主酵菌株發(fā)酵制備威寧豆醬，并與威寧豆醬成品風味對比。

表1 威寧豆醬的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of Weining soybean paste

1.3.4 菌株鑒定

形態(tài)學鑒定：將篩選出的主酵菌株分別劃線接種于LB或PDA培養(yǎng)基上，細菌37℃培養(yǎng)12 h，真菌28℃培養(yǎng)36 h，觀察菌株菌落形態(tài)。細菌進行革蘭氏染色、真菌進行美蘭染色，觀察細胞形態(tài)。然后參照《真菌鑒定手冊》[14]和《伯杰氏細菌手冊》[15]進行初步鑒定。

分子生物學鑒定[16-17]：提取主酵菌株的基因組，然后采用通用引物（見表2）進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，PCR擴增體系：DNA模板2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×Mix 10μL，雙蒸水（ddH2O）7μL，共20μL。PCR擴增程序：95℃預變性8 min；95℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸40 s，30個循環(huán)；72℃再延伸8 min。反應結束后PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。

PCR擴增產物分別與pMD 18-T載體連接，導入DH5a感受態(tài)細胞，提取重組質粒，酶切驗證后送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果在美國國立生物技術信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，選取同源性高的模式菌株，采用MEGA 5軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 通用引物序列Table 2 Sequences of universal primer

VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定：將篩選出的主酵菌株純化后，制成菌懸液備用。選擇相應鑒定卡，按照操作說明用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行分析。

1.3.5 主酵菌株生長曲線的繪制

將篩選出的主酵菌株按1%接種量接入LB或PDA液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定培養(yǎng)液的OD600nm值。以培養(yǎng)時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標，繪制主酵菌株的生長曲線。

1.3.6 主酵菌株發(fā)酵豆醬理化指標的測定

氨基酸態(tài)氮含量：參照國標GB/T 24399—2009《黃豆醬》進行測定；總酸含量：參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法進行測定；水分含量：參照國標GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法進行測定。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

從威寧地區(qū)采集的豆醬樣品中共分離純化出10株真菌（DZ-1～DZ-10）和22株細菌（DX-1～DX-22），將分離的菌株純化后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 主酵菌株的篩選

分別采用分離到的10株真菌和22株細菌進行純種發(fā)酵制備豆醬，參照評分標準對其進行感官評價，結果見表3和表4。由表3可知，22株細菌中，細菌DX-9發(fā)酵的豆醬綜合評分最高，為94分。由表4可知，10株真菌中，真菌DZ-3發(fā)酵的豆醬綜合評分最高，為90分。且2株菌發(fā)酵豆醬風味與威寧豆醬成品風味相似，對威寧豆醬發(fā)酵過程中滋味和氣味的貢獻較大。因此，確定菌株DX-9和菌株DZ-3為主要發(fā)酵菌株。

表3 細菌發(fā)酵豆醬的感官評價Table 3 Sensory evaluation of soybean paste fermented by bacterium

表4 真菌發(fā)酵豆醬的感官評價Table 4 Sensory evaluation of soybean paste fermented by fungus

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學觀察

對主酵菌株DZ-3和DX-9進行形態(tài)觀察，結果分別見圖1、圖2。由圖1可知，菌株DZ-3的菌落呈乳白色、菌落表面光滑、有光澤、邊緣整齊，細胞呈橢圓形。由圖2可知，菌株DX-9的菌落呈白色、無光澤、表面褶皺、邊緣不整齊，細胞呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。因此，參照《真菌鑒定手冊》[14]和《伯杰氏細菌手冊》[15]初步判定菌株DZ-3屬于酵母屬，菌株DX-9屬于芽孢桿菌屬。

圖1 菌株DZ-3的菌落形態(tài)（a）和細胞形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology(a)and cell morphology(b)of strain DZ-3

圖2 菌株DX-9的菌落形態(tài)（a）和細胞形態(tài)（b）Fig.2 Colony morphology(a)and cell morphology(b)of strain DX-9

2.3.2 分子生物學鑒定

菌株DZ-3和DX-9的PCR擴增產物見圖3。由圖3可知，菌株DX-3的ITS PCR擴增產物堿基長度為610 bp左右，菌株DX-9的16SrDNAPCR擴增產物堿基長度為1 410 bp左右，均與預期片段大小一致。PCR擴增產物與載體pMD18-T連接后，送去測序。

圖3 菌株DZ-3和DX-9 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of strain DZ-3 and DX-9

測序結果在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取同源性較高的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4和圖5。由圖4可知，菌株DZ-3與異常威克漢姆（Wickerhamomycesanoma lus anomalus）CBS：1978聚于一支，親緣關系最近，因此，初步判定菌株DZ-3為異常威克漢姆（Wickerhamomyces anomalus）。由圖5可知，菌株DX-9與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，親緣關系最近，因此，初步判定菌株DX-9為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 基于ITS序列分析菌株DZ-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain DZ-3 based on ITS sequences analysis

圖5 基于16S rDNA序列分析菌株DX-9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain DX-9 based on 16S rDNA sequences analysis

2.3.3 VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定

通過VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株DZ-3和DX-9進行鑒定，結果表明，鑒定菌株DZ-3為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株DX-9為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），結果與分子生物學鑒定結果一致。

酵母菌在豆醬發(fā)酵過程中發(fā)酵糖類產生小分子醛、酸、酯等物質，增加醬的風味[18-21]。枯草芽孢桿菌也是豆醬發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌株[22-23]，與豆醬滋味的形成密切相關。

2.4 主酵菌株的生長曲線

菌株DZ-3及菌株DX-9的生長曲線見圖6。由圖6可知，菌株DZ-3的遲滯期為0～4 h，對數(shù)生長期為6～28 h，28 h后進入穩(wěn)定期，32 h后開始進入衰亡期。菌株DX-9的遲滯期為0～4 h，對數(shù)生長期為4～18 h，18 h后進入穩(wěn)定期，26 h后進入衰亡期。生長曲線的測定為兩種菌的培養(yǎng)時間和豆醬發(fā)酵過程中的接種量提供參考依據(jù)。

圖6 菌株DZ-3（A）及菌株DX-9（B）的生長曲線Fig.6 Growth curve of strain DZ-3(A)and DX-9(B)

2.5 純種發(fā)酵豆醬理化指標的測定

氨基酸態(tài)氮是調味品中主要的增味物質，也是發(fā)酵產品發(fā)酵程度的特性指標，氨基酸態(tài)氮含量越高，氨基酸含量越高，營養(yǎng)成分也越高[24-25]。豆醬中的總酸高低也會直接影響豆醬風味、色澤、穩(wěn)定性和品質的高低。

采用篩選獲得的主酵菌株DZ-3和DX-9分別純種發(fā)酵制備威寧豆醬，對豆醬的理化指標進行測定，并與威寧豆醬成品理化指標結果進行比較，結果見表5。

表5 菌株DZ-3和菌株DX-9發(fā)酵豆醬理化指標測定結果Table 5 Determination results of physicochemical index of soybean paste fermented by strain DZ-3 and DX-9

由表5可知，菌株DZ-3發(fā)酵的豆醬的總酸、氨基酸態(tài)氮、水分含量分別為1.53 g/100 g、0.64 g/100 g、55%。菌株DX-9發(fā)酵的豆醬的總酸、氨基酸態(tài)氮、水分含量分別為1.96 g/100 g、0.96 g/100 g、59%。威寧豆醬的總酸、氨基酸態(tài)氮、水分含量分別為1.85 g/100 g、1.02 g/100 g、52%。結果表明，兩種菌發(fā)酵豆醬的總酸、氨基酸態(tài)氮、水分含量均達到國家標準GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求。菌株DX-9發(fā)酵豆醬的總酸、氨基酸態(tài)氮含量和水分含量比菌株DZ-3發(fā)酵的豆醬分別高0.46 g/100 g、0.32 g/100 g和4%，且菌株DZ-3和DX-9純種發(fā)酵的豆醬氨基酸態(tài)氮含量均比威寧豆醬成品低，但菌株DX-9純種發(fā)酵的豆醬僅比威寧豆醬成品低0.06 g/100 g。綜合來看，菌株DX-9在威寧豆醬的發(fā)酵過程中發(fā)酵能力比菌株DZ-3強。

3 結論

本研究從威寧地區(qū)采集的醬曲樣品中初步分離得到22株細菌和10株真菌。采用分離菌株進行純種發(fā)酵制備豆醬，并進行感官評價。結果表明，細菌中，菌株DX-9發(fā)酵豆醬的感官評分最高，為94分；真菌中，菌株DZ-3發(fā)酵豆醬的感官評分最高，為90分，且均與傳統(tǒng)威寧豆醬風味相似。因此，確定這兩株菌為主酵菌株。通過形態(tài)觀察、分子生物學技術及VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)對主酵菌株進行鑒定。結果表明，菌株DX-9為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），菌株DZ-3為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。對菌株DX-9及DZ-3純種發(fā)酵豆醬的理化指標進行測定，結果表明，菌株DX-9發(fā)酵豆醬的氨基酸態(tài)含量為0.96 g/100 g、總酸含量為1.96 g/100 g、水分含量為59%；菌株DZ-3發(fā)酵豆醬的氨基酸態(tài)含量為0.64 g/100 g、總酸含量為1.53 g/100 g、水分含量為55%，均達到國家相關標準要求，且菌株DX-9發(fā)酵豆醬優(yōu)于菌株DZ-3。