青龍衣膏對胃癌BGC-823細胞侵襲能力的影響

崔紅霞，郭雪瑩，王 明，王偉明#

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，黑龍江 哈爾濱 150036； 2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

中藥青龍衣(greenwalnuthusks)是胡桃科胡桃樹屬植物胡桃(Juglandsmandshuricamaxim)和胡桃楸(JuglandsragiaL)未成熟果實的干燥果皮[1]，現(xiàn)代研究結(jié)果表明，青龍衣對胃癌、白血病等具有良好的抗腫瘤活性[2-3]。復(fù)方青龍衣膏的主要成分為中藥青龍衣乙醇提取物，是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院獨立開發(fā)、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的針對消化系統(tǒng)腫瘤的膏劑，2004年獲得醫(yī)院制劑批文[黑藥制字(2004)Z第0061]。前期研究結(jié)果表明，復(fù)方青龍衣膏可抑制胃癌生長，故本研究探討了青龍衣膏對BGC-823細胞侵襲能力的影響，為青龍衣的深入開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細胞

人胃腺癌BGC-823細胞株購自黑龍江省腫瘤研究所。

1.2 藥品與試劑

青龍衣膏由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所制備；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基(美國HYCLONE公司)；Transwell小室(美國康寧公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；噻唑藍(MTT，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)。

1.3 儀器

Safire2高速多通道波長酶標儀(奧地利TECAN公司)；Alpha Imager Is 2200型凝膠成像系統(tǒng)(美國Alphaimager公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測青龍衣膏對胃癌細胞BGC-823生長增殖的影響

將對數(shù)生長期的腫瘤細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，將其分為實驗組和對照組。實驗組細胞加入含不同濃度青龍衣膏(0.818、0.909、1.010、1.123、1.247、1.386、1.540及1.710 mg/ml)的培養(yǎng)液200 μl，對照組細胞加入培養(yǎng)液200 μl。每組設(shè)3個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。每孔加入新鮮配制的含5 mg/ml的MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄上清液，并加入DMSO 150 μl，混勻，在酶標儀上以試驗波長570 nm測定光密度(OD)。計算細胞生長抑制率(GIR)及半數(shù)抑制濃度(IC50)。GIR=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%。IC50的計算公式為：lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]。其中，Xm為lg最大劑量；I為lg(最大劑量/相臨劑量)；P為陽性反應(yīng)率之和；Pm為最大陽性反應(yīng)率；Pn為最小陽性反應(yīng)率。

2.2 MTT法測定青龍衣膏對胃癌細胞株BGC-823黏附能力的影響

將4 ℃過夜融化的Matrigel基質(zhì)膠在無菌條件下包被到96孔板上，每孔50 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)放置30 min，2%胎牛血清封板1 h，每孔接種不同濃度青龍衣膏處理24 h的細胞100 μl，細胞濃度為1×106個/ml，黏附60 min，磷酸緩沖液洗去沒有黏附的細胞，加入新鮮培養(yǎng)基200 μl后，加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，取出，小心吸棄上清液，加入DMSO 150 μl溶解結(jié)晶。采用Safire2高速多通道波長酶標儀在570 nm波長處讀取吸光值。細胞黏附率=實驗組OD570/對照組OD570×100%。

2.3 青龍衣膏對胃癌細胞BGC-823侵襲能力的影響

在transwell小室上室鋪人工基質(zhì)膠模擬體內(nèi)環(huán)境，結(jié)晶紫染色后計數(shù)穿過ECM的細胞數(shù)來代表細胞的侵襲能力。transwell上室均勻鋪Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃放置過夜；消化細胞，上室每孔加入含1.5×105細胞的無血清培養(yǎng)基100 μl；下室中加入10%胎牛血清培養(yǎng)基600 μl；在上室每孔加入不同濃度藥物，小心將細胞放入37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育24 h；取出transwell吸出上室液體，甲醇室溫固定30 min，用棉簽擦去上室表面細胞，風(fēng)干；加入0.1%的結(jié)晶紫染色30 min，緩慢沖洗倒置晾干，顯微鏡下(200倍)拍照，計數(shù)[4-5]。

2.4 青龍衣膏對胃癌細胞株BGC-823遷移能力的影響

用transwell侵襲小室模擬體內(nèi)環(huán)境，結(jié)晶紫染色后計數(shù)穿過ECM的細胞數(shù)來代表細胞的遷移能力。方法與“2.3”相同，但上室不鋪matrigel基質(zhì)膠。

2.5 Western blot法檢測青龍衣膏對胃癌細胞BGC-823環(huán)氧酶2(COX-2)蛋白表達的影響

COX-2過表達的細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力強。因此，COX-2表達可被作為檢測細胞侵襲能力的指標。收集細胞，按照細胞漿蛋白提取試劑盒操作，提取細胞漿蛋白，定量，取蛋白30 μg上樣進行10%的SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別用COX-2抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗膜10 min×3次，曝光成像，凝膠分析軟件進行灰度值分析，以目的基因與GAPDH基因條帶積分的OD比值表示COX-2蛋白表達。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 青龍衣膏對胃癌細胞BGC-823生長增殖的影響

人胃腺癌BGC-823細胞經(jīng)青龍衣膏各濃度作用24、48 h后，IC50分別為(1.3123±0.19)、(1.128±0.105) mg/ml，對腫瘤細胞增殖均表現(xiàn)為不同程度的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的時間-劑量依賴關(guān)系，抑制曲線見圖1。

圖1 青龍衣膏對胃癌BGC-823細胞生長的抑制作用Fig 1 Inhibition of Qinglongyi electuary on the growth of gastric cancer BGC-823 cells

3.2 青龍衣膏胃癌細胞株BGC-823黏附能力的影響

通常，高侵襲能力的腫瘤常伴隨細胞與細胞間黏附力的降低和細胞與胞外基質(zhì)(ECM)間黏附力增強。故根據(jù)“2.1”結(jié)果，采用不明顯影響細胞生長的濃度作為試驗濃度。將細胞分為對照組、低劑量組(0.66 mg/ml)、中劑量組(0.74 mg/ml)及高劑量組(0.82 mg/ml)。結(jié)果顯示，低、中及高劑量組經(jīng)藥物處理24 h后，BGC-823細胞黏附率分別為(88.39±2.51)、(90.23±7.27)及(81.37±2.0)%，對照組為100%，低、高劑量組明顯低于對照組，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明低、高劑量的青龍衣膏能顯著抑制BGC-823細胞與ECM間黏附，見圖2。

圖2 不同濃度青龍衣膏對胃癌BGC-823細胞與ECM 間粘附能力的影響Fig 2 Effects of different concentrations of Qinglongyi electuary on adhesion between gastric cancer BGC-823 cells and ECM

3.3 青龍衣膏對BGC-823細胞侵襲能力的抑制作用

對照組，低、中及高劑量組經(jīng)藥物處理后，BGC-823細胞侵襲細胞數(shù)分別為(95±9.23)、(13±1.1)、(15.1±2.91)及(27.8±4.04)個，低、中及高劑量組的侵襲細胞數(shù)明顯少于對照組，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明不同劑量青龍衣膏能顯著的抑制BGC-823細胞侵襲能力，見圖3—4。

圖3 青龍衣膏對胃癌BGC-823細胞侵襲能力的抑制作用Fig 3 Inhibition of Qinglongyi electuary on the invasion ability of gastric cancer BGC-823 cells

圖4 侵襲穿過基底膜的細胞(×200倍)Fig 4 Cells that invade the basement membrane (×200)

3.4 青龍衣膏對BGC-823細胞遷移能力的抑制作用

對照組，低、中及高劑量組經(jīng)藥物處理后，BGC-823細胞遷移細胞數(shù)分別為(134±23.23)、(27.7±5.16)、(28.7±6.27)及(32±3.65)個，低、中及高劑量組遷移細胞數(shù)明顯少于對照組，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明不同劑量青龍衣膏能顯著的抑制BGC-823細胞遷移能力，結(jié)果見圖5—6。

圖5 青龍衣膏對胃癌BGC-823細胞遷移能力的抑制作用Fig 5 Inhibition of Qinglongyi electuary on the migration ability of gastric cancer BGC-823 cells

圖6 遷移穿過小室上室膜的細胞(×200倍)Fig 6 Cells that migrate through the ventricular membrane of the chamber (×200)

3.5 青龍衣膏對BGC-823細胞COX-2蛋白表達的影響

與對照組比較，低、中及高劑量組的COX-2蛋白表達水平明顯下降，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明青龍衣膏可明顯抑制COX-2蛋白的表達，且隨著劑量的增加，對COX-2表達的抑制作用增強，見圖7。

圖7 青龍衣膏對COX-2表達的影響Fig 7 Effects of Qinglongyi electuary on COX-2 expression

4 討論

體內(nèi)外實驗結(jié)果表明，青龍衣對多種腫瘤有肯定的抗腫瘤效果[6-7]，并發(fā)現(xiàn)青龍衣能通過促進胃癌細胞凋亡[8-9]、抗腫瘤血管生成[10]及調(diào)節(jié)免疫[11]等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，在民間應(yīng)用也有成功案例，但其對胃癌細胞侵襲能力的研究尚未見報道。本研究以自制青龍衣提取物的膏劑為研究對象，檢測此青龍衣提取物對胃癌BGC-823細胞侵襲能力的影響。

腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的黏附和侵襲在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。采用Matrigel模擬體內(nèi)基底膜最真實的體內(nèi)環(huán)境，研究青龍衣提取物對胃癌BGC-823細胞與ECM的黏附與侵襲力能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，青龍衣提取物0.66、0.74及0.82 mg/ml處理后，胃癌BGC-823細胞與Matrigel的黏附能力明顯降低，細胞的遷移和侵襲能力也顯著降低(P<0.01)。表明青龍衣提取物可抑制胃癌侵襲能力。

環(huán)氧酶(COX)是前列腺素合成過程中重要的限速酶。在病理情況下，COX-2的高表達可誘導(dǎo)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[12-14]。本研究中，青龍衣提取物可下調(diào)COX-2的表達，可能與其抑制BGC-823細胞的黏附和侵襲作用密切相關(guān)。

青龍衣的抗腫瘤療效尚缺乏系統(tǒng)的近期療效及遠期療效評價，也沒有其抗腫瘤作用靶點的相關(guān)研究報道，應(yīng)進一步挖掘其有效單體成分以及抗腫瘤作用機制[15]，并探索其在腫瘤靶向治療方面的意義，充分挖掘其潛在的藥用價值。