一種簡易檢測(cè)6-磷酸葡萄糖的方法

徐婷 薛金嫚 陳亞東 劉華 陳鈺佩

摘要：6-磷酸葡萄糖（G6P）是多種代謝途徑的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，一種簡易高效的G6P測(cè)定法建立將有利于深入了解其在有機(jī)體中的代謝狀態(tài)。前期研究發(fā)現(xiàn)，基于離子排斥色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H與示差折光檢測(cè)器的高效液相色譜分析無法有效地將這一化合物與1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸區(qū)分開來。因而，擬建立一種簡便、專一且靈敏，檢測(cè)濃度范圍為0.2～10 μmol/L的G6P的酶學(xué)熒光檢測(cè)法。同時(shí)，我們以模式真核生物酵母為材料，對(duì)G6P的提取方法進(jìn)行改進(jìn)，以使樣本的測(cè)定更加穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：6-磷酸葡萄糖;高效液相色譜;酶學(xué)熒光檢測(cè);酵母

中圖分類號(hào)： Q532+.5? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0209-04

6-磷酸葡萄糖（G6P）是細(xì)胞內(nèi)一種常見的化合物，它由葡萄糖在己糖激酶的作用下生成，在細(xì)胞內(nèi)主要參與3種代謝途徑：（1）進(jìn)入糖酵解途徑，為生物合成提供細(xì)胞能量或碳骨架;（2）進(jìn)入磷酸戊糖代謝途徑，為細(xì)胞提供還原型輔酶Ⅱ（NADPH）和核酸前體;（3）進(jìn)入糖原合成途徑，為糖原合成提供G1P（葡萄糖-1-磷酸）[1]。因此，G6P是生物代謝途徑的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其含量會(huì)影響細(xì)胞活力。已有研究表明，在磷酸戊糖途徑中，葡萄糖經(jīng)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）的作用生成G6P，同時(shí)伴隨著NADPH和中間產(chǎn)物的形成，它們?cè)诙喾N生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的作用[2]。

目前，提取動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)G6P的方法有2種，分別為Antonio法[3]和Ritter法[4]，都是使用三乙醇胺溶液提取G6P。測(cè)定動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)G6P的方法則有色譜法[5-7]、高效液相色譜法（HPLC）[8]和酶學(xué)法[9]。色譜法須要配備昂貴的色譜儀，如Nicolet公司的Magna-IR750傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR），APPLIED SYSTEMS公司的Durasampl IR衰減全反射附件（ATR）[10]。高效液相色譜法雖然可以測(cè)定代謝過程中大多數(shù)有機(jī)酸和糖，但是在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)不能有效分離G6P、果糖-1，6-二磷酸、3-磷酸甘油酸。而酶學(xué)熒光定量法[11]通過放大檢測(cè)信號(hào)，可以提高酶學(xué)測(cè)定的靈敏度[12-13]和準(zhǔn)確性，與高效液相色譜相比，該方法更為有效、經(jīng)濟(jì)。? 目前，在具有細(xì)胞壁的真核生物（諸如酵母與植物）中，測(cè)定G6P的酶學(xué)方法鮮有報(bào)道。細(xì)胞壁的存在很大程度上增加了G6P的提取難度。本研究試圖以模式真核生物——酵母為材料，建立以6-磷酸葡萄糖脫氫酶酶促反應(yīng)[14]為基礎(chǔ)的熒光定量法，用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)G6P的含量。該方法通過硫辛酰胺脫氫酶作用，使G6PD的產(chǎn)物與刃天青進(jìn)行反應(yīng)生成熒光物質(zhì)[15]，放大G6P信號(hào)，從而達(dá)到微量檢測(cè)的目的。鑒于植物細(xì)胞與酵母均存在細(xì)胞壁，本研究建立的方法對(duì)植物體內(nèi)G6P的測(cè)定也具有一定的指導(dǎo)借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 Y10000型野生釀酒酵母（Saccharomyces cerevvisiae）BY4742，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試試劑 刃天青（Sigma，R7017），三乙醇胺（Sigma，900257），6-磷酸葡萄糖-（Sigma，V900924），6-磷酸葡萄糖脫氫酶（Sigma，A5885），硫辛酰胺脫氫酶（Sigma，D5540），煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（Sigma，NADP-RO），3-磷酸甘油酸（Sigma，P8871），果糖-1，6-二磷酸[生工生物工程（上海）股份有限公司，A60048-0025]，甲醇（Amethyst，116481），三氯甲烷（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，分析純），硫酸（西隴化工股份有限公司，分析純）。

1.1.3 供試儀器 小型臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf 5424），-80 ℃ 低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific TSE240V），-20 ℃ 低溫箱（SANYO MDF-U539-C），多功能酶標(biāo)儀（*synergyH1），高速冷凍離心機(jī)（*CF16RXⅡ），真空冷凍干燥機(jī)（D-37520），高效液相色譜儀（Agilent1200型）配RID檢測(cè)器、Agilent色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司），離子排斥色譜柱（Bio-Rad Aminex HPX-87H）。

1.2 酵母細(xì)胞培養(yǎng)

在30 ℃條件下，將細(xì)胞置于缺尿嘧啶（URA）的固體葡萄糖SC培養(yǎng)基板上培養(yǎng)2 d左右，然后選取單菌落于3 mL液體半乳糖SC培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d。測(cè)定D600 nm后轉(zhuǎn)接至 10 mL 液體半乳糖SC培養(yǎng)基中，D600 nm=0.05，培養(yǎng)約10 h左右，取D600 nm=1.00的菌液10 mL（細(xì)胞數(shù)約為2.0×108，干質(zhì)量為 28 mg），5 000 g、離心5 min后棄上清，用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌并懸浮細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中離心后棄上清，于-80 ℃保存。

1.3 提取方法

1.3.1 Antonio法 G6P的提取方法參照Antonio等的報(bào)道[3]，取細(xì)胞數(shù)為2.0×108（干質(zhì)量為28 mg）左右的酵母細(xì)胞用1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，然后加入1 mL預(yù)冷的甲醇/三氯甲烷混合液（體積比為2 ∶ 1），混合后渦旋，于 -20 ℃ 靜置2 h，加入 500 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），18 000 g、4 ℃離心 10 min，轉(zhuǎn)移上層水相，用1 mL 50%甲醇溶液對(duì)三氯甲烷相進(jìn)行再次提取。合并2次提取液，在高速冷凍離心機(jī)中干燥后于-80 ℃保存。

1.3.2 Ritter法 G6P的提取方法參照Ritter等的報(bào)道[4]，取細(xì)胞數(shù)為2.0×108（干質(zhì)量為28 mg）左右的酵母細(xì)胞用 1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，加入600 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），超聲波處理5 min，重復(fù)1次后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，加入600 μL三氯甲烷，渦旋振蕩30～60 s，收集提取液約1 mL。最后，在真空離心干燥機(jī)中干燥后于-80 ℃保存。

1.3.3 Antonio改進(jìn)法 在Antonio法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，取細(xì)胞數(shù)為2.0×108（干質(zhì)量為28 mg）左右的酵母細(xì)胞用 1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，加入200 μL預(yù)冷的甲醇/三氯甲烷混合液（體積比為2 ∶ 1），0.3 g酸洗過的玻璃珠（直徑為0.2～0.4 mm）渦旋儀振蕩6 min（30 s冰上，30 s渦旋交替），加入500 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），18 000 g，4 ℃ 離心10 min，轉(zhuǎn)移上層水相，用1 mL 50%甲醇溶液對(duì)三氯甲烷相進(jìn)行再次提取。合并2次提取液，加入等體積的ddH2O，于-80 ℃冷凍后轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)，干燥完全后于 -20 ℃ 保存。

1.3.4 Ritter改進(jìn)法 在Ritter法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，取細(xì)胞數(shù)為2.0×108（干質(zhì)量為28 mg）左右的酵母細(xì)胞用1 mL PBS溶液洗滌2次，去上清，加入200 μL預(yù)冷的50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine兩性離子緩沖液，pH值為5.4），0.3 g酸洗過的玻璃珠（直徑為0.2～0.4 mm）渦旋儀振蕩6 min（30 s冰上，30 s渦旋交替），再次加入800 μL 50%甲醇溶液，1 mL三氯甲烷，混勻離心后取上層水相，18 000 g，4 ℃，離心 10 min。提取物中加入等體積的ddH2O，于-80 ℃冷凍后轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)，干燥完全后于-20 ℃保存。

1.4 G6P的熒光檢測(cè)法

將提取物溶于50 μL ddH2O中，取10 μL樣品或G6P的標(biāo)準(zhǔn)品（濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0和10.0 μmol/L）于96孔板中，加入90 μL混合液：50 mmol/L的三乙醇胺（TEA）（pH值為7.6）、1.0 mmol/L MgCl2、100 μmol/L NADP+、10 μmol/L 刃天青、0.1 U/mL G6PD和0.2 U/mL硫辛酰胺脫氫酶。反應(yīng)液在室溫條件下靜置30 min后，在激發(fā)光530 nm、熒光590 nm條件下進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)照組以TEA替代G6PD，其余條件保持一致。對(duì)照組的熒光檢測(cè)值為非G6P的干擾物質(zhì)造成的熒光讀數(shù)。

1.5 高效液相色譜檢測(cè)法

1.5.1 色譜條件 離子排斥色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H型（300 mm×7.8 mm，9 μm），流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4溶液，流量為0.6 mL/min，柱溫為60 ℃，檢測(cè)器為RID，進(jìn)樣體積為20 μL。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 用超純水分別配制濃度為1 g/L的1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸和6-磷酸葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品以及混合標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備溶液，然后按0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、32.0、64.0 mmol/L的濃度配制G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液以確定其測(cè)定范圍，接著按照“1.5.1”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法檢測(cè)G6P的非專一性

HPLC常用于糖濃度的測(cè)定，在檢測(cè)過程中，G6P標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸極為接近。如圖1所示，1 g/L 1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸和 6-磷酸葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為 5.928、6.365、

6.210 min，峰面積分別為368 984、231 419、232 975 mAU·min，而混合樣品中只出現(xiàn)1個(gè)保留時(shí)間，為6.115 min，峰面積為736 738 mAU·min（面積約為3種標(biāo)準(zhǔn)品面積之和）。HPLC難以有效區(qū)分以上3種物質(zhì)，因此無法通過該方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)G6P的濃度。

2.2 酶學(xué)熒光檢測(cè)法的建立

酶學(xué)熒光檢測(cè)法是通過放大酶學(xué)信號(hào)，以檢測(cè)G6P的微量變化。如圖2所示，游離態(tài)G6P在G6PD的作用下形成 6- 磷酸葡萄糖內(nèi)酯，并將NADP+還原生成NADPH，而NADPH在硫辛酰胺脫氫酶的作用下可以與刃天青反應(yīng)，生成熒光性物質(zhì)。G6P濃度的計(jì)算公式如下：

G6P濃度=（試驗(yàn)值-背景值）-標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×樣品質(zhì)量×稀釋倍數(shù)。

其中，背景值（即沒有加6-磷酸葡萄糖脫氫酶處理）代表樣品中含有的游離態(tài)NADPH及其他干擾物質(zhì)的含量;試驗(yàn)值（即加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶處理）代表樣品中G6P和干擾物質(zhì)的含量。

利用標(biāo)準(zhǔn)品制作G6P標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)重復(fù)2次，如圖3所示，在0.2～10.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)，G6P含量和反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，且標(biāo)準(zhǔn)誤差值較低。為避免系統(tǒng)誤差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，每次測(cè)定G6P的含量時(shí)均重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用HPLC測(cè)定G6P時(shí)，樣品量至少為1 mL，檢測(cè)濃度范圍為0.4～32.0 mmol/L，而酶學(xué)熒光檢測(cè)法只需 10 μL 的樣品，檢測(cè)的摩爾濃度范圍為0.2～10.0 μmol/L。說明使用酶學(xué)熒光檢測(cè)法測(cè)定G6P，靈敏度高，穩(wěn)定性好，對(duì)待測(cè)樣品中G6P的濃度要求低。

2.3 G6P提取方法的優(yōu)化

Antonio法和Ritter法是目前已知可以提取細(xì)胞內(nèi)G6P的2種方法[3-4]，其分別采用凍融和超聲波處理方式來破碎動(dòng)物細(xì)胞，但這2種方法均無法完全破碎酵母細(xì)胞，在濃縮提取液時(shí)，高速離心濃縮須持續(xù)離心24 h且效果不佳。為解決上述問題，在Antonio法和Ritter法的基礎(chǔ)上本研究使用玻璃珠和凍干機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎和提取液凍干處理。如圖4所示，在Antonio法和Ritter法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Antonio改進(jìn)法與其他3種方法得到的G6P濃度存在極顯著差異。已有文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)G6P含量約為 714 pmol/mg DW，Antonio法和Ritter法所測(cè)得的G6P濃度僅分別為211.8、264.9 pmol/mg DW，且標(biāo)準(zhǔn)誤差大，這2種方法可行性較低[3]。Antonio改進(jìn)法和Ritter改進(jìn)法測(cè)得的G6P濃度分別為774.0、 365.8 pmol/mg DW。因此，使用Antonio改進(jìn)法-酶學(xué)熒光定量檢測(cè)法可有效測(cè)定酵母體內(nèi)G6P的濃度。

經(jīng)研究推測(cè)，Antonio改進(jìn)法提取效率高的原因是（1）通過玻璃珠使酵母細(xì)胞破碎完全，可提高所測(cè)定的G6P濃度值，此方法也適用于含有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞;（2）提取的過程中先加入三氯甲烷，可以破壞細(xì)胞膜引發(fā)細(xì)胞死亡，使細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)酶瞬間失活，從而減少了由G6P降解所引起的損耗;（3）通過真空凍干機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥處理，由于冷凍干燥機(jī)可以將溫度維持在-20 ℃以下，以保證將所有樣品凍干至粉末狀，大大提高了提取效率。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在原有測(cè)定G6P方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適度改進(jìn)，從而建立了適用于具有細(xì)胞壁細(xì)胞的提取方法。此方法亦可應(yīng)用于植物細(xì)胞中，但由于植物細(xì)胞比酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，還須要進(jìn)一步試驗(yàn)以摸索并改善相關(guān)條件。該方法除了可用于測(cè)定G6P的含量，還可用于胞內(nèi)NAD+和NADPH含量的測(cè)定。由于目前普遍使用試劑盒檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)NAD+和NADPH的含量，但試劑盒法并不適用于大樣本及植物細(xì)胞的測(cè)定，而使用Antonio改進(jìn)法-酶學(xué)熒光定量檢測(cè)法可以大大降低成本，并為進(jìn)一步測(cè)定具有細(xì)胞壁的細(xì)胞體內(nèi)NAD+和NADPH的濃度提供借鑒。

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