抗根腫病大白菜小孢子培養(yǎng)及分子鑒定

陳麗瀟 王躍華 劉鑫 惠麥俠 趙利民 趙小平

摘要：以10個抗根腫病大白菜品種為試材，研究影響小孢子出胚的因素，并對DH植株進(jìn)行根腫抗性分子檢測。結(jié)果表明，基因型是影響出胚的最主要因素，參試的10個品種中僅有3個出胚，其中15CR82出胚率最高，為 3.36個/蕾?；蛐瓦€決定了胚狀體的類型及大小，胚的大小對于轉(zhuǎn)綠成苗率有一定影響。一般直徑大于2 mm的胚狀體容易轉(zhuǎn)綠成苗。用根腫抗性基因CRa的特異分子標(biāo)記CRaEXON4-3篩選DH群體，獲得27個攜帶抗性基因植株。

關(guān)鍵詞：大白菜;抗根腫病;游離小孢子培養(yǎng)

中圖分類號： S634.103? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0141-03

大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis）屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種，是一種起源于我國的重要蔬菜作物。根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron）侵染引起的一種世界性病害[1-2]，主要感病植物有大白菜、青菜、芥菜等十字花科蔬菜[3]。根腫病病菌被歸為原生界根腫菌門，其通過侵染十字花科植物根毛導(dǎo)致根部薄壁細(xì)胞增生而形成腫瘤[4]，從而影響植物吸水功能[5]，使地上部分生長遲緩、缺水萎蔫[6]。該病最初于1737年被發(fā)現(xiàn)在地中海西岸（英國）和歐洲南部（前蘇聯(lián)列寧格勒），由于該病傳染力強(qiáng)，傳播途徑多，感病植物根部釋放的休眠孢子在土壤中存活可達(dá)10年[7]，隨后在世界各地的十字花科蔬菜種植區(qū)域蔓延擴(kuò)散。又由于發(fā)病初期蔬菜地上部分的癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，使得發(fā)病地區(qū)減產(chǎn)嚴(yán)重，根腫病又有“根癌”之稱，已成為一種世界性難題。

近年來，根腫病的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治及抗病育種等。而從環(huán)境保護(hù)、成本、管理難易程度等方面考慮，選用抗病品種是目前防治根腫病的最佳方案[8]。游離小孢子培養(yǎng)（isolated microspore culture，簡稱IMC）技術(shù)是由Nitsch在進(jìn)行花藥培養(yǎng)的同時創(chuàng)建和發(fā)展的，1982年德國的Lichter率先在甘藍(lán)型油菜上成功地進(jìn)行了游離小孢子培養(yǎng)，并發(fā)現(xiàn)小孢子胚胎及其再生植株的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于花藥培養(yǎng)[9]，這引起了育種工作者的濃厚興趣，此后小孢子培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)作物，尤其是蕓薹屬蔬菜作物中得到了迅速發(fā)展。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，可以快速純化含有抗病基因的植株，并從大量的抗病雙單倍體（doubled haploid，簡稱DH）群體中，尋找具有優(yōu)良生物性狀的植株作為親本進(jìn)行下一步的育種工作。本研究以10份市售的抗根腫病大白菜品種為材料，篩選易出胚的基因型材料，并利用根腫抗性基因CRa分子標(biāo)記對種質(zhì)進(jìn)行篩選，以期為大白菜抗根腫病新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試抗根腫病大白菜材料為15CR37、15CR38、15CR53、15CR82、15CR104、15CR121、15CR122、15CR128、15CR132、15CR136，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)十字花科蔬菜研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試材準(zhǔn)備 材料于2016年10月15日播種于陜西省油菜雜交中心大田，自然條件下春化，常規(guī)田間管理，于2017年3月26日始花期至4月22日終花期取材培養(yǎng)。

1.2.2 游離小孢子培養(yǎng) 在大白菜初花期和盛花期，于每天08：00—11：30摘取健壯花序上未開的花蕾，花蕾長度為 2.0～3.5 mm。用鑷子挑開花蕾，小心擠出花粉，利用顯微鏡挑選細(xì)胞為圓球形，小孢子發(fā)育處于單核靠邊期，且細(xì)胞有一定透光度的花蕾。如細(xì)胞為三角形及其他不規(guī)則形狀，并且細(xì)胞顏色極淺則是時期過早，花蕾過小;如細(xì)胞成橢圓形且中部較暗透光較差，則是花粉已成熟，花蕾過大。挑選好的花蕾先用75%乙醇消毒1 min，再用0.1%氯化汞消毒15 min，無菌水沖洗3遍。加入6～10 mL的B5洗滌培養(yǎng)基（含13%蔗糖），用玻璃棒碾壓花蕾使花蕾破碎，小孢子游離于B5培養(yǎng)基中，用50 μm孔徑的尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液于離心管中。1 200 r/min 離心5 min，棄去上清液后加入B5培養(yǎng)基懸浮花粉，再次離心，重復(fù)3次后棄去上清液，加入含有100 mg/L秋水仙堿的NLN-13液體培養(yǎng)基（含13%蔗糖）懸浮小孢子。將小孢子懸浮液稀釋后分裝于4個60 mm的培養(yǎng)皿中，每個皿的培養(yǎng)基體積約為5 mL，用封口膜封口，放于32 ℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)48 h。取出未污染的樣品，將懸浮液加入離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄去上清，加入10 mL NLN-10液體培養(yǎng)基（含10%蔗糖）懸浮花粉，將懸浮液加入到90 mm培養(yǎng)皿中，封口后放入25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。經(jīng)過10～15 d出現(xiàn)肉眼可見的白色細(xì)小顆粒，將出現(xiàn)白色細(xì)小顆粒的培養(yǎng)皿放到室溫下的搖床上避光振蕩培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計(jì)出胚率及胚胎類型。胚狀體的直徑小于1 mm時，不統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。

1.2.3 基因型對小孢子胚胎發(fā)生的影響 10份大白菜材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，暗培養(yǎng)10 d、振蕩培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)出胚率及胚胎類型。每個品種各挑取100個花蕾分裝于4個培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿25個花蕾。

1.2.4 胚狀體種類對轉(zhuǎn)綠成苗的影響 所有胚狀體均統(tǒng)一轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L KT+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂），放到光—暗周期為12 h—12 h，光照度為 1 500 lx，溫度為24 ℃的培養(yǎng)間，2周后分別統(tǒng)計(jì)其轉(zhuǎn)綠率。

1.2.5 DH群體分子篩選 所有獲得的小孢子植株，剪取少量葉片組織，用簡化CTAB法提取DNA，用筆者所在課題組開發(fā)的根腫病抗性基因CRa特異分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)條帶類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對大白菜游離小孢子出胚率的影響

不同基因型的抗根腫病大白菜小孢子的胚胎發(fā)生能力差異很大。由表1可知，10個供試材料有3個得到了胚狀體，成功率為30%。其中15CR82出胚率最高，為3.36個/蕾，其次為15CR136，出胚率為1.32個/蕾，15CR53的出胚率最低，為0.84個/蕾。

2.2 基因型對大白菜游離小孢子胚狀體類型的影響

胚狀體的形狀和大小與基因型也存在很密切的關(guān)聯(lián)。材料15CR82的胚狀體主要為子葉型胚與球形胚，且數(shù)量多體積小，直徑一般為0.5～3.0 mm，直徑小于1 mm的胚數(shù)量較多。材料15CR53和15CR136的胚狀體則主要為子葉型胚與畸形胚，且體積較大，直徑一般為1～8 mm（圖1）。

2.3 胚狀體類型對大白菜胚狀體轉(zhuǎn)綠的影響

由表2可知，當(dāng)胚狀體的體積達(dá)到一定大小時，有助于其轉(zhuǎn)綠。子葉胚相對于其他類型胚狀體更容易成苗，子葉胚寬度小于2 mm時 一般很難轉(zhuǎn)綠 也就無法成苗。15CR53和15CR136的子葉胚較大，容易轉(zhuǎn)綠，其轉(zhuǎn)綠率分別為67.3%、69.7%，15CR82的胚狀體數(shù)量最多，體積小，大部分直接白化、褐化，轉(zhuǎn)綠的胚狀體數(shù)量較少，轉(zhuǎn)綠率極低，只有19.8%。

2.4 DH群體分子鑒定

由圖2可知，對獲得的40個DH植株進(jìn)行CRa基因的分子檢測，植株間表現(xiàn)多態(tài)性，擴(kuò)增條帶大小為705 bp的有27株，含抗性基因CRa，表現(xiàn)為純合抗病，擴(kuò)增條帶大小為 413 bp 的有9株，不含抗性基因CRa，表現(xiàn)為感病。由結(jié)果可知，純合抗病植株與感病植株比為3 ∶ 1。4、27、28、29號樣品條帶大小為500 bp，與其他材料的大小不一致，表現(xiàn)為材料間多態(tài)性。

3 結(jié)論與討論

基因型對游離小孢子培養(yǎng)的胚狀體發(fā)生來說是最關(guān)鍵的因素之一，Bhatia等利用30個印度花椰菜品種進(jìn)行研究，其中13個品種得到了胚狀體[10]。盧松等用3個微型結(jié)球白菜品種進(jìn)行試驗(yàn)，有1個品種得到了胚狀體[11]。本試驗(yàn)以10個抗根腫病大白菜品種進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，其中有3個品種得到了胚狀體。15CR82的出胚率最高（3.36個/蕾），而材料15CR53的出胚率相對較低（0.84個/蕾）。胚狀體的發(fā)生不僅受到基因型的影響，而且還受一些外部條件的影響，同一品種胚狀體的發(fā)生具有很大的偶然性，可能某一天出胚率極

高，也可能沒有發(fā)生胚狀體。在這個未知條件還沒有解決之前，由于花期時長有限，試驗(yàn)中盡量保證每天有足夠的花蕾是獲得較多DH植株的一個簡單直接的方式。

除了基因型對小孢子培養(yǎng)的影響外，如何高效利用已經(jīng)形成的胚狀體是一個亟待解決的問題。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胚狀體的大小對于轉(zhuǎn)綠率的影響比較大，子葉胚寬度小于2 mm時，一般很難轉(zhuǎn)綠，推測由于出胚率較高的品種、有限的空間及培養(yǎng)基限制了胚狀體生長空間及獲得較多營養(yǎng)物質(zhì)。筆者嘗試將較大的胚狀體轉(zhuǎn)出后，換成新的NLN-10培養(yǎng)基繼續(xù)避光振蕩培養(yǎng)，結(jié)果顯示該方法可促進(jìn)胚狀體的生長，提高轉(zhuǎn)綠率。歸因于增加胚狀體生存空間及可用營養(yǎng)物質(zhì)，同時置換掉培養(yǎng)基中胚狀體產(chǎn)生的一些有害代謝產(chǎn)物。同一品種在不同時期的出胚率也不一樣，說明外在環(huán)境條件對胚狀體發(fā)生也會產(chǎn)生一定影響，探究利于出胚的環(huán)境條件，也是一個可以有效提高易出胚品種出胚數(shù)的方法。

利用抗根腫病基因特異分子標(biāo)記可以快速檢測大白菜材料含有的抗病基因，本研究利用CRa特異分子標(biāo)記檢測獲得的40個DH植株，有27個攜帶抗性基因CRa，純合抗病植株與感病植株比為3 ∶ 1。所用供試母株材料為雜合植株，根據(jù)孟德爾遺傳定律中的分離定律，預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果純合抗病植株與純合感病植株比為1 ∶ 1，與本次試驗(yàn)結(jié)果相差較大。由于成苗過程中胚狀體有大量損耗，所以無法判斷是含有抗根腫病Cra基因的花粉更容易形成胚狀體，還是含有抗病基因的胚狀體更容易成苗。在后續(xù)試驗(yàn)中，可以通過拓寬供試材料基因型，增加出胚率、提高成苗率等有效方法來獲取更多抗根腫病純合種質(zhì)資源，進(jìn)而應(yīng)用于抗根腫病育種實(shí)踐當(dāng)中。

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