葉疫病菌侵染芒果后葉片細(xì)胞壁降解酶活性測定

楊鄭州 黃柳芳 謝曉娜 蘇仕林

摘要：為明確葉疫病病菌侵染芒果后細(xì)胞壁降解酶活性的變化，以臺農(nóng)芒果葉作為試驗(yàn)材料，通過體外培養(yǎng)的方法分離得到芒果葉疫病菌，將其接種于離體的芒果幼葉，利用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法和紫外分光光度計(jì)法檢測病原菌侵染過程中細(xì)胞壁降解酶活性的變化。結(jié)果表明，在細(xì)胞壁降解酶中，β-葡萄糖苷酶活性最高，羧甲基纖維素酶（Cx）活性與多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性次之，聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性最低;纖維素酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，并且纖維素酶比果膠酶對芒果葉片的致病作用明顯。

關(guān)鍵詞：芒果;葉疫病;細(xì)胞壁降解酶;活性測定;3，5-二硝基水楊酸法;紫外分光光度計(jì)法;減少產(chǎn)量損失

中圖分類號： S436.67+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0138-03

芒果被稱為熱帶水果之王。在我國，芒果主要種植在東南部的云南和南部的貴州與廣西地區(qū)[1-2]，芒果葉疫病別稱為交鏈孢霉葉枯病，主要危害樹冠下老葉，在一些實(shí)生苗與嫩葉上發(fā)病率高，其生長溫度條件充足，在雨水充足時(shí)期發(fā)病率高，隨著雨水的降臨，葉疫病的菌絲可侵染嫩葉及抵抗力弱的老葉，具有一定的傳染性。嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致葉片大量枯死，影響植株生長。植物細(xì)胞壁是植物健康的保障，病原菌通過入侵植物細(xì)胞壁，分泌細(xì)胞壁降解酶使植物受到侵染，從而導(dǎo)致病害的發(fā)生。細(xì)胞壁降解酶是病原菌侵染寄主組織的主要致病因子之一[3]，本試驗(yàn)致力于研究植物細(xì)胞壁降解酶的種類與其在致病過程中所起到的作用，為進(jìn)一步研究芒果與葉疫病菌的互作機(jī)制及減少芒果果產(chǎn)量損失提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料為臺農(nóng)芒果，摘取病葉為廣西壯族自治區(qū)百色市右江區(qū)本地臺農(nóng)芒果樹上的老葉，分離純化得到芒果葉疫病病菌，針刺法接種于離體臺農(nóng)芒果幼葉，臺農(nóng)幼苗于2016年9月至2017年1月種植于百色學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓前，待葉長至8張時(shí)，取不同植株同一位置的幼葉，以針刺后不接種菌絲的葉片為空白對照，放于28 ℃條件下倒置培養(yǎng)，分別于接種后2、4、6、8、10、12 d取樣，而后樣品保存于-20 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 摘取疑似芒果葉疫病的臺農(nóng)芒果葉片，于實(shí)驗(yàn)室用流水洗凈，表面消毒后，使用0.1%氯化汞消毒1.5 min，75%乙醇消毒30 s，蒸餾水潤洗3次每次 1 min;所用器皿均已高壓滅菌，利用剪刀裁取病健交界處 0.5 mm2 左右葉片，放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)。通過點(diǎn)接的方法分離純化致病菌。

1.2.2 病原菌反侵染 根據(jù)柯赫氏法則將已純化的菌絲分別接種至同一品種、同一長勢的百色市本地健康無病害的實(shí)生苗上。摘取與葉疫病原癥狀一致的葉片，重新進(jìn)行葉片中致病菌的分離，觀察2種病菌是否為同一種。

1.2.3 酶液的提取 稱取葉片1 g，放入研缽中，進(jìn)行冰浴研磨，1 g樣品中加入5 mL 1 mol/L NaCl提取液（20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH值7.4），然后倒入10 mL離心管中，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，上清液即為酶的粗提液，于 4 ℃ 保存。

1.2.4 羧甲基纖維素酶（Cx）活性測定 量取1 mL粗酶液，加入1 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入1 mL底物（底物配制：稱取0.1 g羧甲基纖維素鈉溶于10 mL pH值為5.0的 50 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中），在50 ℃下酶解 30 min，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS），沸水浴 10 min，取出后經(jīng)流水冷卻，在540 nm處測定吸光度。

1.2.5 β-葡萄糖苷酶活性測定 參照“1.2.4”步驟，底物配制：稱取0.1 g水楊苷溶于10 mL pH值為5.0的 50 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.6 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性測定 參照“1.2.4”步驟，底物配制：稱取0.1 g多聚半乳糖醛酸溶于10 mL pH值為5.0的50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.7 聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性測定 參照“124”步驟，底物配制：稱取0.1 g果膠溶于10 mL pH值為50的 50 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

Cx、β-葡萄糖苷酶、PG與PMG的酶活性單位為50 ℃下1 min催化1 μg還原糖所需酶量，根據(jù)D-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的還原糖，還原糖采用DNS比色法測定。

酶蛋白濃度測定按照Bradford的方法[4]進(jìn)行，用考馬斯亮藍(lán)G-250顯色，在595 nm處比色測定，用小牛血清蛋白（BSA）作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.362 2x+0.078 1，r2=0.998 4。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果葉疫病病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)

由圖1、圖2可知，此次分離得到的病原菌即為芒果葉疫病病原菌細(xì)極鏈格[Alternariatenuissima（Fr.）Wiltsh]，屬半知菌類真菌。濕度大時(shí)病斑上出現(xiàn)灰色霉?fàn)钗?，即病菌分生孢子梗和分生孢子。梗單生?～3根叢生，褐色，偶爾出現(xiàn)1個(gè)膝狀曲折，分生孢子倒棍棒形，單生或2～4個(gè)串生，孢身褐色，大小為（18.8～31.3） μm×（8.0～12.5） μm，具橫隔膜3～6個(gè)，縱隔膜1～3個(gè)，喙變化較大，色略淺，長3.8～11.3 μm。

芒果葉疫病病原菌前期生長較為緩慢，在生長至第3天后生長態(tài)勢急劇上升，第7天可達(dá)到生長頂峰，第8天開始有孢子產(chǎn)生。病原菌菌絲生長形態(tài)細(xì)密、綿軟，菌絲向上生長約0.5 cm，形成內(nèi)凹外凸的形狀，菌絲以散射狀形勢向外擴(kuò)散，孢子以接種中心為圓心向培養(yǎng)基邊緣部分?jǐn)U散，在孢子生成過程中孢子可在培養(yǎng)皿中形成同心圓。

2.2 Cx活性測定

由圖3可知，試驗(yàn)處理組酶活性在接種后4 d達(dá)到高峰，此時(shí)是對照組的1.365倍，隨后酶活性開始下降，在12 d又達(dá)到第3次酶活性高峰，為對照組的3.938倍。對照組酶活性在培養(yǎng)過程中隨著時(shí)間的推移整體逐漸降低。

2.3 β-葡萄糖苷酶活性變化

由圖4可知，β-葡萄糖苷酶在接種后2 d達(dá)到酶活性高峰，是對照組酶活性的1.243倍，試驗(yàn)處理組在接種后10 d達(dá)到第2次酶活性高峰，是對照組酶活性的2.807倍。試驗(yàn)組β-葡萄糖苷酶活性在10 d后開始急劇下降，對照組 β- 葡萄糖苷酶活性隨著時(shí)間的增加而下降。

2.4 PG活性的變化

由圖5可知，接種后2 d試驗(yàn)處理組PG活性低于對照組PG活性，此時(shí)試驗(yàn)組葉片中PG活性受到抑制，接種后6 d PG活性逐漸上升，接種后8 d PG活性達(dá)到峰值，是對照組的2.596倍。對照組PG活性隨著接種時(shí)間的增加整體逐漸減小。

2.5 PMG活性變化

由圖6可知，試驗(yàn)處理組PMG活性在接種后4～6 d內(nèi)無明顯變化，接種8 d后受到明顯抑制，接種10 d后活性達(dá)到高峰，是對照組PMG活性的1.568倍，對照組PMG接種后先急劇下降后達(dá)到平衡。

2.6 酶活醒比較

由圖7可知，芒果感染葉疫病病菌后β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG活性次之，PMG活性最低。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)探討了細(xì)胞壁降解酶的致病性作用，試驗(yàn)從芒果葉疫病病原菌的提取到病原菌的致病機(jī)制研究，期間做了多次預(yù)試驗(yàn)與試驗(yàn)分析，并從中挑選出最佳的試驗(yàn)方案。本研究所用的芒果病葉最佳的消毒方法為流水沖洗5 min，氯化汞消毒溶液消毒1.5 min，75%乙醇消毒30 s，最后得出的芒果病葉細(xì)菌感染率最低。芒果葉疫病具有感染性，可通過空氣中的水與風(fēng)傳播，孢子可隨風(fēng)依附在樹葉上，遇水后生長，因此芒果葉疫病在雨季多發(fā)。病原菌侵染過程中相關(guān)酶的活性出現(xiàn)高低起伏變化可能是活體外葉片的自身免疫作用，β-葡萄糖苷酶在接種后2 d出現(xiàn)酶活性高峰，Cx和PG在接種后 8 d 出現(xiàn)酶活性高峰，這與前人研究結(jié)果一致。李敏等在研究可可球二孢產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶在侵染芒果果實(shí)過程中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)可可球二孢在離體培養(yǎng)條件下或接種芒果果實(shí)后均可產(chǎn)生PG、PMG、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）、果膠甲基反式消除酶（PMTE）及Cx，其中PG、PMG和Cx活性較高，PGTE和PMTE活性極低[5]。在大量分泌的3種細(xì)胞壁降解酶中，PG和Cx活性高峰出現(xiàn)較早，PMG活性高峰出現(xiàn)較遲。芒果葉疫病病原菌侵染過程中，β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG活性次之，PMG活性最低。王麒然等研究花生品種對葉腐病的抗性鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，花生葉腐病菌能產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶等細(xì)胞壁降解酶，無論活體外養(yǎng)還是接種植株體內(nèi)都表現(xiàn)為果膠酶活性最高，其次是漆酶和木聚糖酶，活性最弱的是纖維素酶[6]。高增貴等研究發(fā)現(xiàn)，玉米莖腐病菌在活體內(nèi)和活體外都能分泌細(xì)胞壁降解酶，其產(chǎn)生的果膠酶、纖維素酶等都對玉米胚根有明顯的浸解作用，并且隨著酶液濃度的升高浸解能力也逐漸增強(qiáng)，表明果膠酶、纖維素酶等細(xì)胞壁降解酶是玉米莖腐病菌的重要致病因子[7]。Lalaoui等研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶在菜豆褐斑病菌（Phyllosticta phaseolina）致病中起重要作用[8]。陳曉林等研究發(fā)現(xiàn)，腐爛病菌在寄主體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的活性變化規(guī)律不同，PMG和木聚糖酶在接種后最先被檢測到活性顯著升高，PMG活性于接種后第13天達(dá)到高峰，隨后活性降低，而木聚糖酶和其他3種酶活性則隨接種天數(shù)的增加活性不斷增強(qiáng);5種細(xì)胞壁降解酶中，Cx最大酶活性最低，而木聚糖酶活性最高，是其他酶最大酶活性的1.74～7.44倍[9]。因此，細(xì)胞壁降解酶是一些植物病原菌的重要致病因子。Kang等研究發(fā)現(xiàn)，引起小麥根腐的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）分泌果膠酶活性高的菌株致病性相對強(qiáng)，并且果膠甲基半乳糖醛酸酶（PME）和PG不僅比其他酶活性高，而且它們之間還存在協(xié)同作用，突顯果膠酶是該病菌的主要致病因子[10-11]。張大智等探討了芒果細(xì)菌性角斑病在發(fā)病過程中產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的種類及其在致病過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁降解酶在病原菌的入侵和致病過程中起重要作用[12]。果膠酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，纖維素酶主要降解次生壁，致病作用發(fā)生在后期，并且果膠酶比纖維素酶對芒果葉片的致病作用明顯[12]。但本研究發(fā)現(xiàn)起主要致病作用的是纖維素酶，纖維素酶活性先達(dá)到峰值，之后果膠酶活性才升高，這可能是因?yàn)橹虏【牟煌鴮?dǎo)致了二者分泌先后順序的差異。本研究通過對芒果活體接種葉疫病病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶進(jìn)行活性分析，也表明β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG、PMG活性與病菌侵染芒果及葉疫病發(fā)生密切相關(guān)，進(jìn)一步明確了細(xì)胞壁降解酶在一些病菌致病中起著重要作用，是主要的致病因子的觀點(diǎn)。

本研究表明，病原菌侵染宿主時(shí)，起主要作用的細(xì)胞壁降解酶是β-葡萄糖苷酶，羧甲基纖維素酶二者都屬于纖維素酶，纖維素酶起作用不斷分解植物的細(xì)胞壁，降低機(jī)體免疫力;而在接種之后，PG與PMG開始活躍，二者都屬于果膠酶，致病菌開始生長;也即是纖維素酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，并且纖維素酶比果膠酶對芒果葉片的致病作用明顯。

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