蓖麻GA20-氧化酶基因表達分析

侯宇奇 李貞景 翟雨佳 謝彩梅 武淑芬 王昌祿

摘要：為研究GA20氧化酶基因在蓖麻中的表達情況，以具有典型代表的4種高稈和4種矮稈蓖麻品種為材料，采用實時定量PCR和熒光定量PCR技術，對GA20氧化酶基因在蓖麻的不同器官及器官發(fā)育的不同階段的表達特異性進行分析。結(jié)果表明，蓖麻的矮化不是由GA20氧化酶基因的突變所引起;GA20氧化酶基因在種子和嫩葉中的表達量最高，在成熟葉中可大量表達，在莖中可微量表達，在根中可痕量進行表達;同一生長時期，高稈品種的GA20氧化酶基因表達量明顯高于矮稈品種，不同生長時期高稈品種GA20氧化酶基因的表達量呈現(xiàn)由高到低再升高的變化趨勢，而矮稈蓖麻GA20氧化酶基因的表達量始終處于相對較低水平。該研究結(jié)果為進一步闡明蓖麻GA20氧化酶基因的功能特征及揭示其參與調(diào)控植物生長的分子機制提供了參考。

關鍵詞：GA20氧化酶;RT-PCR;熒光定量PCR;表達量

中圖分類號： S565.601? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0059-04

蓖麻（Ricinus communis L.）是一種經(jīng)濟潛力十分巨大的工業(yè)油料作物，是世界十大油料作物之一，具有極高的應用價值和巨大的經(jīng)濟前景[1]。以蓖麻籽為原料生產(chǎn)的蓖麻油具有性能穩(wěn)定、不易變性等特點，在極端溫度環(huán)境下仍能保持原有的燃燒特性。此外，蓖麻油是目前羥基脂肪酸的唯一來源[2]，以蓖麻油為基礎原料的深加工產(chǎn)品多達3 000多種，廣泛用于航空、紡織、環(huán)保、醫(yī)藥等領域[3]。然而，我國主推種植的蓖麻品種絕大多數(shù)屬高稈品種，因植株高大，單位面積單株數(shù)過少且抗倒伏性較差，使我國蓖麻種植面臨的機械化收割困難和種植效益低下等問題日益突出，影響了農(nóng)民種植蓖麻的積極性，使我國蓖麻原料的供應不足，成為嚴重制約我國蓖麻產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸[4]。

實踐證明，矮化育種是解決蓖麻種植業(yè)發(fā)展瓶頸的有效途徑之一。通過植株適當矮化，改善株型，增大群體結(jié)構(gòu)，能夠提高植物光合效率等能力[5]。赤霉素（gibberellins，簡稱GAs）是一類普遍存在于高等植物體內(nèi)的類四環(huán)二萜羧酸，在促進植物生長發(fā)育過程中起重要作用[6]。GA20氧化酶是赤霉素生物合成中最重要的限速酶之一[7]，其在植物徒長型和矮化型突變體內(nèi)的表達量存在很大的差異。因此，GA20氧化酶家族基因常被用于植物矮化基因工程育種和降低植物內(nèi)源GAs水平的生理效應研究中[8]。

國外水稻GA20氧化酶基因研究表明，正義轉(zhuǎn)化表現(xiàn)出植株增高，反義轉(zhuǎn)化表達植株明顯“矮化”[9-12]。國內(nèi)也有報道指出，GA20氧化酶功能缺失的突變體具半矮生的表型，而過量表達GA20氧化酶能導致赤霉素的過量合成和明顯加快植株生長。通過RNAi抑制水稻中OsGA20氧化酶基因表達，能導致水稻內(nèi)源GA1含量減少并使植株矮化[13]。上述赤霉素及GA20氧化酶的研究，為矮化型轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的培育奠定了基礎，但針對蓖麻種的GA-20氧化酶基因的研究還處于初級階段，相關報道較少。

本研究以蓖麻為材料，采用實時定量PCR和熒光定量PCR技術對GA20氧化酶基因在不同高矮蓖麻植株中的不同器官及器官發(fā)育不同階段的表達特異性進行了初步研究，為最終利用轉(zhuǎn)基因技術實現(xiàn)蓖麻矮化育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年3月至2015年11月在天津科技大學食品工程與生物技術學院進行。選取8個蓖麻品種，其中高稈品種4個：淄蓖麻5號（市場購買）、蓖綠2號（南開大學蓖麻工程研究中心惠贈）、CSR24.181（購于通遼市農(nóng)業(yè)科學研究院）、浙蓖17號（浙江省農(nóng)業(yè)科學院惠贈）;矮稈品種4個：中北4號、中北5號（購于山西經(jīng)作蓖麻科技有限公司）、天蓖26號、浙蓖36號（浙江省農(nóng)業(yè)科學院惠贈）。

試驗用大腸桿菌（Eschericha coli）DH5α菌株，購自Takara（寶生物工程大連有限公司）;根癌農(nóng)桿菌（Agrobaoterium tumefaciens）EHA105菌株，由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所惠贈;克隆載體（pUC-T Vector）購自康維世紀生物科技有限公司;Plant RNA Kit試劑盒購自OMEGA公司;pBI-121雙元表達載體、pHANNIBAL載體由筆者所在實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 GA20氧化酶基因組織特異性表達分析 提取淄蓖麻5號蓖麻品種的種子、根、莖、嫩葉、成熟葉等器官的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以各器官的cDNA為模板，以蓖麻Actin基因作為內(nèi)參基因，以表1中的引物進行半定量RT-PCR分析。構(gòu)建反應體系，擴增程序為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析GA20氧化酶基因在不同器官表達模式。

1.2.2 不同品種蓖麻GA20氧化酶基因編碼區(qū)比較 提取4個典型蓖麻矮稈品種中北4號、中北5號、天蓖26號、浙蓖36號，以及4個典型蓖麻高稈品種蓖綠2號、淄蓖麻5號、CSR24.181、浙蓖17號葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)目的基因設計特異性引物（F：5′-ATGGCAATAGAGTGCATCAA-3′和R：5′-CTACTTTCTCTGTTGAACCC-3′）。分別以8個不同品種的cDNA為模板，對其GA20氧化酶基因的編碼區(qū)進行PCR擴增，反應體系及擴增程序同“1.2.1”節(jié)，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠瓊脂糖電泳檢測分析。對8個品種擴增得到的PCR產(chǎn)物進行純化回收，將回收的PCR產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進行比對分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR（real-time fluores-cence quantitative PCR） 對8個蓖麻品種進行播種，以第30天、第60天、第75天、第90天及第105天5個生長時期的新生幼嫩葉片的cDNA為模板，以“中北4號”在第30天的嫩葉cDNA為對照，以蓖麻Actin為內(nèi)參基因，對8個蓖麻品種在不同時期的GA20氧化酶基因進行相對定量分析。

以蓖麻GA20氧化酶基因的mRNA序列（XM_002510827.1）為模板，依據(jù)熒光定量引物的設計原則，通過NCBI的Primer-BLAST設計1對最優(yōu)的特異性引物GA20-ox B（F：5′-TACTGCGAGGCTATGAGCAC-3′和R：5′-GGATCGCAATGAGGTCCAGT-3′），以蓖麻Actin基因為內(nèi)參基因，設計內(nèi)參基因引物Actin B（F：5′-CGAGCAAGAACTTGAGACTGC-3′和R：5′-CTCGTGGATTCCTGCAGCTT-3′）。使用TAKARA公司的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ進行實時熒光定量PCR試驗。

依據(jù)試劑盒說明，構(gòu)建RT-qPCR反應體系，擴增程序為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，45個循環(huán);95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s。每個反應3個平行，重復1次。反應完成后，記錄試驗數(shù)據(jù)，通過MxPro軟件，采用相對定量分析方法中的2-ΔΔCT法，對GA20氧化酶基因的表達量進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA20氧化酶基因組織特異性表達分析

分別提取淄蓖麻5號蓖麻的種子、根、莖、嫩葉、成熟葉等不同器官的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，蓖麻不同器官總RNA提取28S、18S條帶較完整，經(jīng)酶標儀檢測其D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0之間，質(zhì)量符合下一步試驗要求。

將從不同器官提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA作為模板，進行實時定量PCR分析，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，在蓖麻的種子、根、莖、嫩葉、成熟葉中GA20氧化酶基因都有表達，但表達水平存在明顯差異。GA20氧化酶基因在種子和嫩葉中表達量最高，其次是在成熟葉中可進行大量表達，在莖中可微量表達，在根中有痕量表達。表明GA20氧化酶基因在蓖麻不同器官中具有不同的表達模式。

2.2 不同品種蓖麻的GA20氧化酶基因編碼區(qū)比較

分別以8個高矮蓖麻品種的cDNA為模板，對蓖麻GA20氧化酶基因的編碼區(qū)進行PCR擴增，用1%凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，8個品種的GA20氧化酶基因擴增效果良好，切膠回收目標條帶，可直接進行測序，得到的序列片段長度均為1 137 bp。

將8個蓖麻品種的RcGA20氧化酶基因進行序列比對，其結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，8個高矮不同蓖麻品種的RcGA20氧化酶基因核苷酸序列中存在少數(shù)堿基差異，但所對應氨基酸序列并不存在差異，由此說明，試驗使用的中北4號、中北5號、天蓖26號、浙蓖36號這4種典型矮稈蓖麻品種在生長中表現(xiàn)出的矮化現(xiàn)象，不是由于RcGA20氧化酶基因突變所引起的。

2.3 GA20氧化酶基因的實時熒光定量表達分析

選取的5個生長時期的擴增曲線均達到平臺期，且擴增效果良好;熔解曲線顯示，各擴增條帶均只有1個尖銳的峰，沒有雜峰出現(xiàn)，說明擴增產(chǎn)物穩(wěn)定準確，擴增產(chǎn)物單一，沒有非特異性擴增，各生長時期的電泳結(jié)果良好，得到清晰單一的條帶，同樣也驗證了無非特異性擴增，熒光定量PCR結(jié)果可信。從各個時期的電泳圖還可以出，8個不同品種在同一個時期的PCR產(chǎn)物電泳條帶亮度不一，表明GA20氧化酶基因的表達均存在差別。

采用相對定量分析方法對8個蓖麻品種在不同時期GA20氧化酶基因相對表達分析匯總?cè)鐖D5所示。在蓖麻播種后的第30天、第60天、第75天、第90天及第105天5個時期，4個高稈蓖麻品種的GA20氧化酶基因表達量明顯高于4個矮稈蓖麻品種的基因表達量，且與植株高矮表現(xiàn)一致。播種后第30天（生長初期）與播種后第90天（生長旺盛期），高稈蓖麻與矮稈蓖麻品種之間GA20氧化酶基因表達量變化的差異更為明顯。在這5個生長時期中，高稈蓖麻品種GA20氧化酶基因的表達量是由高到低再升高的變化趨勢，而矮稈蓖麻品種GA20氧化酶基因的表達量都始終處于相對較低的水平。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著基因工程技術的不斷發(fā)展，已經(jīng)有20～30種高等植物的GA20氧化酶基因被克隆分離鑒定出來，有的已被轉(zhuǎn)化到其他植物體內(nèi)，相關結(jié)果已經(jīng)對其生物功能及作用機制進行了深入研究和分析[14-15]。

Kang等從正在發(fā)育的西瓜種子中克隆得到了GA20氧化酶基因，進一步研究發(fā)現(xiàn)，GA20氧化酶基因在西瓜胚株中強烈表達，但在成熟種子中卻幾乎檢測不到GA20氧化酶基因的表達[16]。Vidal等從柑橘中克隆得到GA20氧化酶基因，在頂端和葉片中強烈表達，但在節(jié)間、節(jié)點和根部只是微量表達[17]。由此可以看出，GA20氧化酶基因在植物體內(nèi)表達分布上存在著較大差異。

本研究中，在蓖麻的種子、根、莖、嫩葉、成熟葉中GA20氧化酶基因都有表達，但表達水平存在明顯差異。GA20氧化酶基因在種子和嫩葉中表達量最高，其次是在成熟葉中高量表達，在莖中微量表達，在根中痕量表達。表明GA20氧化酶基因在蓖麻不同器官中具有不同的表達模式。

Eriksson等將克隆得到的擬南芥GA20氧化酶基因轉(zhuǎn)入雜交楊中使其超量表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)赤霉素含量增多，葉片變大，樹體的主干和直徑變長[18]。Dayan等將擬南芥GA20氧化酶基因轉(zhuǎn)化煙草使其過表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草在早期營養(yǎng)生長時期，莖的高度有很明顯提高，并且纖維產(chǎn)量也有很大程度增多[19]。

本研究對8個不同高矮蓖麻品種的GA20氧化酶基因的編碼區(qū)進行比對分析，證明選取的4種典型矮稈蓖麻品種的矮化不是由于GA20氧化酶基因突變所引起的，采用熒光定量PCR對8個不同高矮品種的不同生長時期GA20氧化酶基因的相對表達量分析表明，高稈蓖麻品種的GA20氧化酶基因表達量明顯高于矮稈蓖麻品種的基因表達量，且與植株高矮表現(xiàn)一致。在這5個生長時期，高稈蓖麻品種GA20氧化酶基因的表達量是由高到低再升高的變化趨勢，而矮稈蓖麻品種GA20氧化酶基因的表達量都始終處于相對較低的水平。

本研究結(jié)果表明，蓖麻的GA20氧化酶基因與其他大多數(shù)植物的GA20氧化酶基因功能相似，在赤霉素合成過程中可以催化形成具有生物活性的GAs。這也說明，蓖麻GA20氧化酶基因的表達差異會影響赤霉素的合成，是影響植株表現(xiàn)高矮的重要原因之一。該結(jié)果為進一步明確GA20氧化酶基因的功能特征及揭示其參與調(diào)控植物生長的分子機制奠定了基礎，為利用轉(zhuǎn)基因技術進行矮化蓖麻育種提供了參考。

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