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    碳青霉烯類耐藥的大腸埃希菌毒力因子與耐藥基因相關(guān)性研究

    2019-07-06 10:43宋真金炎楊蕾路超白媛媛郝瑩瑩
    新醫(yī)學(xué) 2019年3期
    關(guān)鍵詞:毒力亞型菌株

    宋真 金炎 楊蕾 路超 白媛媛 郝瑩瑩

    【摘要】目的 分析碳青霉烯類耐藥的大腸埃希菌(E.Coli)耐藥基因型與所含的毒力因子的關(guān)系。方法 PCR檢測E.Coli毒力因子和耐藥基因;采用Fisher確切概率法對耐藥基因和毒力因子的關(guān)系進行分析。結(jié)果 95.7%(22/23)菌株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)基因陽性,43.5%(10/23)菌株檢出胞外黏多糖相關(guān)基因,87.0%(20/23)菌株檢出P菌毛相關(guān)基因。耐藥基因CTX-M-15型比CTX-M-55型菌株攜帶毒力因子papGⅡ的概率低(P = 0.049)。耐藥基因NDM-1陽性菌株比NDM-5陽性菌株中毒力因子papGⅢ攜帶率高(P = 0.047)。 結(jié)論 ESBL陽性菌株中不同CTX-M、NDM亞型與毒力因子papGⅡ、papGⅢ具有一定的相關(guān)性,毒力因子的攜帶情況與E.Coli耐藥情況可能有關(guān)。

    【關(guān)鍵詞】大腸埃希菌;毒力因子;耐藥基因;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌

    【Abstract】Objective To investigate the correlation between the genotype of drug-resistant genes and the virulence factors in carbapenem-resistant Escherichia coli(E.Coli) strains.? Methods The virulence factors and drug-resistant genes were detected by PCR. The relationship between drug resistance genes and virulence factors was analyzed by Fishers exact test.? Results A total of 95.7% (22/23) of the bacterial strains were positive for extended spectrum beta-lactamase (ESBLs) gene, 43.5% (10/23) positive for the extracellular polysaccharide-related genes, and 87.0% (20/23) positive for the P fimbriae-related genes. The positive rate of virulence factors papG Ⅱ in the CTX-M-15 strain was significantly lower compared with that in the CTX-M-55 strain (P = 0.049). The positive rate of virulence factor papG Ⅲ in the NDM-5 positive strain was considerably higher than that in NDM-1 positive strains (P = 0.047).? Conclusions The genotypes of CTX-M and NDM among ESBLs positive strains were asssociated with virulence factors papG Ⅱ or papG Ⅲ? virulence factors might be associated with the drug resistance genes in E.Coli.

    【Key words】Escherichia coli;Virulence factor;Drug resistance gene;Extended spectrum beta-lactamase;Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae

    大腸埃希菌(E.Coli)是引起醫(yī)院內(nèi)感染最常見的病原菌。根據(jù)致病力的不同,E.Coli可劃分為3大類:共生性、腸道內(nèi)致病性及腸道外致病的E.Coli[1]。主要引起泌尿系統(tǒng)感染的腸道外致病E.Coli稱為尿道致病性E.Coli,它具有可以躲避宿主免疫防御系統(tǒng)的致病因子,可以定植于泌尿系統(tǒng)黏膜上皮細(xì)胞,甚至侵入黏膜上皮細(xì)胞形成持留性的感染[2]。非復(fù)雜性尿路感染的菌株主要由低致病力的A群和B1群引起[3]。近年,B2群中出現(xiàn)了攜帶多種毒力因子及氟喹諾酮耐藥基因和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)基因的菌株,這引起了全球的重視[4]。

    碳青霉烯類藥物是對抗腸桿菌科多重耐藥菌株最有效的抗菌藥物,具有抗菌譜廣、殺菌活性大的特點。近年來,該類抗生素在臨床廣泛應(yīng)用,耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細(xì)菌(CRE)正在逐漸增加。由于CRE同時也對β-內(nèi)酰胺類藥物以外的大部分常用抗生素耐藥,碳青霉烯類耐藥的高產(chǎn)毒株將給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn),也為公共衛(wèi)生安全敲響警鐘。為了調(diào)查濟南地區(qū)碳青霉烯類耐藥E.Coli(CR-ECO)菌株中高致病力菌株的分布情況,課題組對本院2015年臨床分離的23株CR-ECO菌株進行了耐藥基因、毒素基因擴增及系統(tǒng)進化分群,并對耐藥基因與毒力因子的相關(guān)性進行了分析。

    材料與方法

    一、材 料

    1.菌株來源

    2015年全年山東省立醫(yī)院共分離臨床感染患者來源的E.Coli 1 575株,剔除同一患者和同一部位的重復(fù)分離株,對于任一種碳青霉烯類藥物耐藥的E.Coli即認(rèn)為是CR-ECO,共檢出CR-ECO 38株,其中23株保留有菌種。所有菌株均采用梅里埃VITEK微生物鑒定儀進行菌種鑒定,并采用生物梅里?;|(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間微生物鑒定質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對菌種進行再次確認(rèn)。

    2.主要試劑與儀器

    VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)(梅里埃公司,法國),時間飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)(梅里埃公司,法國),Densichek比濁儀(梅里埃公司,法國),35 ℃細(xì)菌培養(yǎng)恒溫孵箱 (精宏實驗設(shè)備有限公司,上海),PCR儀(Applied Biosystems?,美國),Bio-Rad電泳儀(Bio-Rad公司,美國),黑馬GSG-2000凝膠成像拍照系統(tǒng) (黑馬醫(yī)學(xué)儀器,中國)。50×TBE 電泳緩沖液為自配,引物由上海生物工程有限公司合成,PCR擴增反應(yīng)體系Premix Taq? 購自大連寶生物(TAKARA,大連)有限公司,Gel-Red核酸染料、100 bp DNA Ladder、核酸瓊脂糖凝膠購自百泰克公司。

    二、方 法

    1.碳青霉烯類耐藥表型篩選

    按CLSI推薦的mCIM法篩選碳青霉烯類耐藥菌株。同時用E.Coli(ATCC 25922)和肺炎克雷伯菌5748分別作陰性和陽性的質(zhì)控對照。

    2. 菌株進化分群

    使用引物對ChuA、YjaA、TspE4C2.、TspE4Ⅱ片段進行PCR擴增,引物及退火溫度見參考文獻[5]。擴增為陽性的片段送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行一代測序,測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中片段進行在線BLAST比對,確認(rèn)為目標(biāo)片段。進化分群的決策流程[2]。

    3.毒力基因及ESBL基因檢測采用PCR擴增

    引物合成參照文獻[6-8] ,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。模板制備:EP管中加入1 ml去離子水,刮取黃豆粒大小對數(shù)生長期純培養(yǎng)菌苔置于管中,渦旋震蕩混勻,置于沸水浴中煮10 min。12 000×g離心10 min,上清液即為DNA模板,將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中,將模板DNA保存于-20℃冰箱備用。

    耐藥基因的PCR檢測:碳青霉烯酶包括Ambler A組酶(blaNMC、blaKPC、blaSME、blaGES、blaIMI)、AmblerB組酶(blaNDM、blaIMP、blaSIM、blaVIM、blaGIM、laSPM)和Ambler D組酶(blaOXA)。其他β-內(nèi)酰胺酶包括除碳青霉烯以外的β-內(nèi)酰胺酶,包括AmpC酶(blaACC、blaACT、blaBIL、blaCMY、blaDHA、blaFOX、blaLAT、blaMIR和blaMOX)和ESBL(blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M)。反應(yīng)體系(25 μl):上、下游引物各0.2 μmol /L,PCR反應(yīng)體系混合液10 μl,模板2 μl,加滅菌雙蒸水至20 μl。引物同參考文獻[7] 。每批PCR試驗進行陽性和陰性質(zhì)控。

    毒力因子的PCR檢測:毒素擴增通過5個多重PCR反應(yīng)完成。采用25 μl反應(yīng)體系,除了加*引物所采用的濃度為0.3 μM,其他引物的濃度均為0.6 μM。分為下面5個多重PCR反應(yīng)完成毒素基因擴增[7-8]:①多重PCR反應(yīng)1:PAI、papA、 fimH、kpsMT Ⅲ、? papEF和ibeA;②多重PCR反應(yīng)2:fyuA、sfa/focDE、bmaE、papG allele Ⅲ、iutA和K1;③多重PCR反應(yīng)3:*nfaE、*papC、*papG allele Ⅰ、*kpsMT Ⅱ、rfc和hlyA;④多重PCR反應(yīng)4:gafD、cvaC、cdtB、 focG、traT和papG alleleⅡ;⑤多重PCR反應(yīng)5:*afa/draBC、*sfaS、*cnf1、papG alleleⅠ、papG allelesⅡ、papG alleles Ⅲ和K5.PCR產(chǎn)物電泳:配制1.5%瓊脂糖電泳凝膠,電泳緩沖液為0.5×TBE,吸取5 μl PCR產(chǎn)物上樣,所用電壓為110 V,電泳時間為40 min,用核酸染料染色后使用天能成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并拍照。擴增陽性標(biāo)本測序確認(rèn)為目標(biāo)條帶。

    三、統(tǒng)計學(xué)處理

    應(yīng)用 SPSS 13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。定性資料組間比較采用Fisher確切概率法,P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié)果

    一、大腸埃希菌菌株進化分群情況

    23株臨床菌株中有16株屬于B1群,3株屬于D群,4株屬于A群。沒有檢出B2群。具體情況見表1。

    二、大腸埃希菌菌株所攜帶毒力因子情況

    所有菌株均未檢出sfaS、sfa/focD、focG、gafD、afa/draBC、fimH、nfaE、cdtB、hlyA、cnf1、iut、fyuA、ibeA、rfc、pap AH、cvaC、pap EF、traT基因。共10株菌株檢出胞外黏多糖相關(guān)基因cps(kpsMTⅢ/kpsMTⅡ/K5)。攜帶有P菌毛papG基因菌株共20株,攜帶有papGⅡ的菌株共19株,檢出papGⅢ基因的菌株共11株。檢出P菌毛papC基因的菌株共3株,其中2株同時檢出papG和papC基因。3株菌株檢出致病島相關(guān)基因(PAI)。9株菌株檢出M型菌毛基因(bmaE)。7株檢出鐵獲得通路(iroN)基因。

    三、E.Coli菌株所攜帶耐藥基因情況

    23株菌株中共有20株NDM基因陽性,12株為NDM-5亞型,6株為NDM-1亞型,1株為NDM-3亞型,1株為NDM-7亞型。22株攜帶ESBL基因,CTX-M和TEM為最常見的ESBL基因,經(jīng)過測序、BLAST比對進一步明確CTX-M基因亞型和TEM基因亞型。19株所攜帶TEM基因均為產(chǎn)TEM-1亞型。檢出率最高的CTX-M亞型為CTX-M-14亞型,共13株;次之為CTX-M-15亞型,共6株,CTX-M-55亞型共6株。16株菌株同時檢出兩種以上ESBL基因,6株菌株同時檢出兩種亞型CTX-M基因。耐藥基因檢測匯總情況見表2。

    四、E.Coli β內(nèi)酰胺耐藥基因與致病因子的相關(guān)性

    各ESBL基因型菌株中攜帶cps、bmaE、papG Ⅲ、PAI、iroN、papC致病因子的概率無統(tǒng)計學(xué)差異。攜帶CTX-M-15的菌株比攜帶CTX-M-55的菌株中papG Ⅱ陽性率低(P = 0.049)。攜帶NDM-1菌株比攜帶NDM-5菌株中papG Ⅲ陽性率高(P = 0.047)。具體結(jié)果見表3。

    討論

    系統(tǒng)分群是根據(jù)ChuA、YjaA、TspE4C2的不同組合對腸道外感染E.Coli進行分子分型的重要方式,可分為A、B1、B2、D群,致病力大小從強到弱分別為B2、D、B1、A群[5, 9]。根據(jù)Ejrnaes等[6]的研究,B2群可以引起持續(xù)性尿路感染,具有較強的致病性。本次研究中的CRE菌株大部分屬于致病力較弱的B1群,小部分為A和D群,未檢出高致病力的B2群。盡管在本實驗?zāi)退幘曛猩形礄z出高致病力的B2群菌株,但毒素擴增研究證實大部分菌株攜帶胞外多糖等多種毒力因子。尤其值得關(guān)注的是,檢出了3株D群菌株,表現(xiàn)為更強的黏附力和耐藥性。

    細(xì)菌的致病性又稱為毒力,包括表面保護素、各類侵襲性酶和細(xì)菌毒素。其中,細(xì)菌侵襲性黏附、繼而感染的關(guān)鍵在于黏附因子的存在。菌毛與細(xì)菌的致病力密切相關(guān),是黏附因子的重要組成部分。引起腎盂腎炎的大腸埃希菌中80%以上具有P菌毛,也就是腎盂腎炎相關(guān)性菌毛(P pili)[10]。根據(jù)受體的不同papG分為三型,其中Ⅰ型papG和Ⅱ型papG是人類特異性黏附素,主要導(dǎo)致人類腎盂腎炎,Prs菌毛也就是Ⅲ型papG,主要與膀胱炎和動物感染相關(guān)[10]。本研究中的菌株,1株分離自血液,2株分離自胸腔積液,4株分離自尿道,3株分離自創(chuàng)面,6株分離自呼吸道,7株分離自腹腔,尿道和腹腔來源的菌株全部檢出papG基因,部分菌株同時檢出2種亞型papG基因。3株菌株未檢出papG基因,其中2株分離自呼吸道,1株分離自創(chuàng)面。上述結(jié)果證明在呼吸道、尿道感染和腹腔感染中papG均具有重要作用。

    PAI位于細(xì)菌染色體上,是編碼致病因子的基因簇,兩端常攜帶插入元件或重復(fù)序列[11]。PAI通常攜帶分泌性蛋白或表面蛋白基因,例如溶血素和菌毛等。本實驗中攜帶PAI基因的菌株中1例分離自血、1例分離自腹腔、1例分離自痰標(biāo)本。3株P(guān)AI陽性菌株的M菌毛、papG Ⅱ和papG Ⅲ均陽性,因此我們推測有更高的黏附力。鐵離子作為細(xì)菌生長繁殖所必需的元素,有些細(xì)菌能夠直接從宿主細(xì)胞獲取鐵,這使得它們在惡劣環(huán)境下有更強的適應(yīng)能力并使毒力增強。研究證實,分離自雞的攜帶CTX-M-9亞群E.Coli中,iroN基因的檢出率顯著高于攜帶CTX-M-1基因亞群和不攜帶CTX-M基因的菌株。本研究中,各ESBL基因亞型菌株中iroN的檢出率相近。

    綜上所述,我院最常見的ESBL基因為CT- X-M-15、CTX-M-14、CTX-M-55。ESBL基因和致

    病基因相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),NDM-1陽性菌株比NDM-5陽性菌株容易檢出papG Ⅲ基因,papG Ⅱ基因檢出率在CTX-M-15陽性菌株中低于CTX-M-55陽性菌株。由于本實驗涉及菌株數(shù)量較少,E.Coli中致病基因和耐藥基因的相關(guān)性尚待進一步確認(rèn)。

    參 考 文 獻

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    (收稿日期:2018-12-28)

    (本文編輯:楊江瑜)

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