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    中藥小薊不同藥用部位體外抗炎、促凝血的作用研究*

    2019-07-05 07:09:14王鶴辰包永睿李天嬌劉金瑛孟憲生
    關(guān)鍵詞:小薊凝血酶原藥用

    王鶴辰,包永睿,2,3,王 帥,2,3,李天嬌,2,3,劉金瑛,2,3,孟憲生,2,3**

    (1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 大連 116600;2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 大連 116600;3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室 大連 116600)

    小薊(Cirsium setosum(Willd.)MB.)俗稱“刺兒菜”,《中國藥典》記載,小薊“涼血止血,祛瘀消腫?!庇糜隰?,吐血,尿血,便血,崩漏下血,外傷出血,癰腫瘡毒[1]。關(guān)于小薊的藥用部位的功效,在不同的典籍中有不同的描述。如《本草圖經(jīng)》中記載:“小薊生搗根絞汁服,以止吐血,衄血、下血?!薄妒?jì)總錄》中記載小薊治療妊娠墮胎后出血不止:“小薊根葉(銼碎)、益母草(去根,切碎)各五兩。以水三大碗,煮二味爛熟去滓至一大碗,將藥于銅器中煎至一盞,分作二服,日內(nèi)服盡。[2-3]”等。小薊用藥的現(xiàn)代研究表明,小薊有止血、收縮血管、抗菌、抗炎、抗癌等作用[4,5]。然而在目前的中藥開發(fā)理論指導(dǎo)下的小薊藥效研究,大都集中在一種或幾種活性物質(zhì)的量的變化與藥效的關(guān)系上[6-9],對(duì)不同的用藥部位的研究卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究小薊根莖葉花在成分與抗炎,止血藥效方面的區(qū)別。

    本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)照品比對(duì)鑒定色譜峰的種類,以不同藥用部位的指紋圖譜作為物質(zhì)基礎(chǔ),比較小薊不同藥用部位提取物的抗炎與促凝血藥效的區(qū)別,使用灰色關(guān)聯(lián)計(jì)算軟件計(jì)算出檢定出的每種成分對(duì)抗炎與凝血酶原指標(biāo)的貢獻(xiàn)程度,嘗試篩選出治療一種病癥的最優(yōu)藥用部位,建立了多種化合物與藥效的聯(lián)系[10]。提出了一個(gè)精準(zhǔn)的分析方法,為傳統(tǒng)中藥小薊的合理使用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器

    NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱(德國NUAIRE公司);Agilent 1290型快速高效液相色譜儀(安捷倫公司)。

    1.2 試劑與藥材

    KM小鼠(遼寧長生生物有限公司,許可證號(hào):SCXK(遼)2018-0301),乙腈(色譜純,德國Merck公司);冰乙酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);小鼠凝血酶原(PT)酶聯(lián)免疫試劑盒;小薊藥材(購自山東,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室許亮教授鑒定為菊科植物小薊(Cirsium setosum(Willd.)MB.)的干燥全株)。

    1.3 供試品溶液的制備

    將小薊藥材按根、莖、葉、花分開,粉碎,過3號(hào)篩,各取粉末約5.0 g,置于圓底燒瓶中,精密加入200 mL的95%乙醇溶液,加熱回流提取1 h,放冷,濾過,取續(xù)濾液搖勻過0.22 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

    1.4 小薊不同藥用部位指紋圖譜的建立

    1.4.1 色譜條件

    色譜柱Agilent poroshell SB-C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm),流動(dòng)相乙腈(B)-0.5%冰乙酸(A),梯度洗脫,0-6min 5.0%-13%B,6-20 min 13%B,20-60 min 13%-22%B,60-90 min 22.0%-100.0%B,柱溫30℃,檢測(cè)波長:260 n,供試品進(jìn)樣量10 μL。

    1.4.2 HPLC指紋圖譜的建立

    取1.3項(xiàng)供試品溶液按2.2.1項(xiàng)色譜條件,進(jìn)行分析檢測(cè),得到小薊藥材不同入藥部位的液相圖譜。將圖譜信息導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012版),得到小薊不同用藥部位的指紋圖譜。

    1.5 對(duì)照品比對(duì)鑒定色譜峰成分

    經(jīng)前期文獻(xiàn)調(diào)研,明確了多種在小薊藥材中可能存在的與抗炎、促凝血相關(guān)的活性成分[11,12]。經(jīng)過比對(duì)保留時(shí)間,最終確定了11種存在于小薊藥材中的成分。

    1.6 小薊不同部位提取物在抗炎,止血方面的藥效學(xué)評(píng)價(jià)

    1.6.1 小薊不同部位提取物對(duì)小鼠炎癥RAW264.7細(xì)胞的抑制作用

    RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中,取4種供試品溶液各2.5 mL,濾過,揮干后分別溶于10 mL培養(yǎng)液中(經(jīng)計(jì)算,濃度為每毫升培養(yǎng)液中含0.062 5 g生藥提取物)。待細(xì)胞貼壁后,將孔內(nèi)空白培養(yǎng)液替換為加藥培養(yǎng)液作用24 h(每組十個(gè)復(fù)孔)。使用MTT法染色,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算方法如下。

    1.6.2 小薊不同部位提取物對(duì)小鼠血漿中凝血酶原指標(biāo)的影響

    將60只KM小鼠(雄性,20-22 g)按根,莖,葉,花,西陽,空白平均分成6組,每組10只,西陽藥物選用維生素K3。每次按0.025 g生藥量/只給藥,西陽按每次0.0125 g·只-1給藥,空白組給予相同體積生理鹽水。連續(xù)灌胃7天,以肝素鈉為抗凝劑取血漿,按試劑盒說明書操作,每組取5個(gè)復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè),將每個(gè)復(fù)孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,根據(jù)試劑盒的原理,酶標(biāo)儀的示數(shù)越大,產(chǎn)生的指標(biāo)物質(zhì)越多,說明藥效越好。

    1.7 灰色關(guān)聯(lián)度分析

    分別將小薊四個(gè)不同部位提取物對(duì)RAW細(xì)胞的抑制率、四個(gè)不同部位提取物對(duì)小鼠凝血酶原的指標(biāo)數(shù)值作為母序列,圖譜中11種成分的峰面積作為子序列,采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件(GreyModeling V3.0)進(jìn)行分析。得出小薊不同藥用部位色譜峰與其對(duì)RAW細(xì)胞的抑制率與小鼠凝血酶原指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)(貢獻(xiàn)程度)。

    2 結(jié)果

    小薊不同用藥部位化合物保留時(shí)間與峰面積信息(表1),指紋圖譜信息(圖1)。

    體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,小薊花的藥效最強(qiáng)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的抑制率最大,根次之,莖與葉對(duì)RAW264.7細(xì)胞的抑制率作用不大(圖2)。試劑盒的結(jié)果數(shù)據(jù)顯示,小薊花對(duì)小鼠凝血酶原指標(biāo)影響最大,葉次之,莖與根對(duì)指標(biāo)影響較小(圖3)。

    使用GreyModeling V3.0軟件,計(jì)算出小薊不同藥用部位的色譜峰面積與RAW細(xì)胞的抑制率以及小鼠凝血酶原指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)信息(圖4)。結(jié)果顯示,綠原酸、橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷對(duì)抑制炎癥細(xì)胞增值(抗炎)與升高凝血酶原指標(biāo)(止血)的關(guān)聯(lián)系數(shù)與其他成分相比較高,說明這四種成分對(duì)抗炎與止血的貢獻(xiàn)程度較大。

    圖1 小薊不同部位指紋圖譜與共有峰

    表1 小薊藥材中不同部位的化學(xué)成分

    3 討論

    中藥的藥用部位在典籍中有很多記載,其中針對(duì)不同的病癥,往往施用不同的藥用部位。這提示現(xiàn)代的研究者,應(yīng)該開展針對(duì)不同部位的相關(guān)研究。中藥的現(xiàn)代研究表明,中藥的藥效與中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)緊密相關(guān),通過對(duì)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究可以對(duì)中藥的傳統(tǒng)理論賦予現(xiàn)代的科學(xué)解釋[13]。中藥中成分組成復(fù)雜多樣,只通過測(cè)定其中一種或幾種成分的含量通常無法全面地說明中藥質(zhì)量與療效的好壞[14]。所以,研究生藥不同采收時(shí)間、不同用藥部位化學(xué)成分差異與不同病癥療效之間的關(guān)系,明確生藥的精準(zhǔn)應(yīng)用意義重大。

    圖2 小薊不同部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞的體外抑制率

    圖3 小薊不同部位的小鼠凝血酶原(PT)試劑盒結(jié)果(P<0.05)

    本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)中藥小薊為研究對(duì)象,建立了不同藥用部位的指紋圖譜,針對(duì)外抗炎藥效與凝血酶原(PT)指標(biāo),研究了小薊不同部位的精準(zhǔn)使用。結(jié)果顯示,不同的部位成分種類與含量差異較大,從指紋圖譜中峰面積及數(shù)量可以看出,小薊全株中4個(gè)部位的化學(xué)成分具有一定的差異性。小薊花中成分種類最多,根中成分種類最少,而莖與葉中成分種類基本一致,含量有所區(qū)別。

    圖4 GreyModeling V3.0軟件計(jì)算出小薊中11種成分對(duì)抗炎,凝血的貢獻(xiàn)程度(P<0.05)

    小薊可清熱消腫,在前期的相關(guān)研究中,我們發(fā)現(xiàn)小薊黃酮中的一些成分可以對(duì)癌細(xì)胞有較好的抑制作用[15],而炎癥與癌癥的產(chǎn)生往往存在先后順序[16]。這也提示我們,研究小薊提取物的抗炎作用有很大的意義。古籍中記載小薊能“涼血止血”,在歷史上小薊也多用于治療血流不止。而止血與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)凝血的概念類似,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為凝血其基本過程是一系列蛋白質(zhì)的有限水解過程,大體上分為三個(gè)階段,凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纖維蛋白形成,其中凝血酶原的形成是整個(gè)凝血過程的重要一步(在體內(nèi)需要維生素K參與)。

    本實(shí)驗(yàn)選取凝血酶原作為檢測(cè)指標(biāo),以維生素K3作為西陽對(duì)照組,小薊不同部位提取物對(duì)指標(biāo)的影響也就反映了其對(duì)促進(jìn)凝血的效果,數(shù)值越大,產(chǎn)生的促凝血指標(biāo)物質(zhì)的量與陽性藥維生素K3越接近。體外藥效結(jié)果顯示,小薊花的抗炎效果最好,小薊根也有一定的效果。而凝血酶原(PT)試劑盒的結(jié)果表明,小薊花的促凝血效果最好,除西陽組外,產(chǎn)生的指標(biāo)物質(zhì)最多,小薊葉也有一定的效果。試劑盒與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,小薊不同部位化學(xué)成分種類與含量的差異是導(dǎo)致藥效有區(qū)別的原因?;疑P(guān)聯(lián)度計(jì)算軟件的結(jié)果顯示,綠原酸、橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷等成分對(duì)小薊提取物的體外抗炎效果與影響凝血酶原指標(biāo)的產(chǎn)生貢獻(xiàn)程度與其他成分相比較大并存在差異。植物化學(xué)研究表明,小薊主要含有黃酮類、酚酸類以及甾醇類化合物。其中,黃酮類成分是影響其藥理學(xué)活性的主要因素?,F(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究表明小薊中的一些成分具有止血、抗炎、抗腫瘤、抗微生物等作用。其中綠原酸、咖啡酸可以通過影響NF-κB信號(hào)通路,減少炎癥介質(zhì)的釋放。蒙花苷能緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷,橙皮苷通過降低毛細(xì)管脆性,有保護(hù)毛細(xì)血管的作用[17-20]。本實(shí)驗(yàn)的灰色關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)結(jié)果也佐證了小薊黃酮類物質(zhì)的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。

    中藥的現(xiàn)代化已經(jīng)實(shí)踐多年,成果顯著。隨著分析與檢測(cè)手段的不斷進(jìn)步,對(duì)于傳統(tǒng)理論的科學(xué)解釋也越來越豐富[21-23]。研究中藥不同部位的使用,為中藥的現(xiàn)代化打開了一個(gè)新的思路。本實(shí)驗(yàn)為小薊藥材不同藥用部位的合理使用提供了一個(gè)科學(xué)的依據(jù)及分析方法,也為提高小薊藥材的治療效果提供了一個(gè)理論支持。

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