紅花寄生對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的干預(yù)作用＊

楊興鑫，彭小驥，胡海波，董金材，顧 雯，梁 麗，梁小燕，熊獻(xiàn)琪，何旭東，俞 捷＊＊

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 昆明 650500；2.昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室昆明 650500；3.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 贛州 341000）

痛風(fēng)（Gout）是由于嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄障礙所致的一組臨床癥候群，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石（Tophi）形成和關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重者可致骨關(guān)節(jié)病變和關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙與畸形[1]。多與現(xiàn)代人飲食無(wú)度、酗酒、高嘌呤飲食、家族遺傳史、肥胖、創(chuàng)傷、手術(shù)及一些藥物的誘發(fā)有關(guān)。

目前常用于治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的化學(xué)藥主要有非甾體類(lèi)抗炎藥（NSAIDs）、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素等，其中秋水仙堿是治療急性發(fā)作的傳統(tǒng)藥物，其不良反應(yīng)較多，主要是胃腸道反應(yīng)；間歇期和慢性期則采用抑制尿酸生成藥、促尿酸排泄藥（如丙磺舒、苯溴馬隆、苯磺唑酮）等[2-4]。雖然這些化學(xué)藥品能有效控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及產(chǎn)生降尿酸作用，但均存在毒副作用較大，不良反應(yīng)多，易復(fù)發(fā)，價(jià)格昂貴或不宜長(zhǎng)期服用等缺點(diǎn)。

中藥及天然藥物具有療效確切、毒副作用低，及多組分、多靶點(diǎn)綜合作用特點(diǎn)，是藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉，可從中藥及天然藥物資源中開(kāi)發(fā)安全高效的治療痛風(fēng)的藥物。目前發(fā)現(xiàn)復(fù)方四妙散、二妙丸等經(jīng)典復(fù)方，以及萆薢、牛膝、土茯苓、秦艽、虎杖、大黃等單味中藥均具有良好的痛風(fēng)治療作用[5]。

紅花寄生為桑寄生科植物紅花寄生Scurrula parasitica Lour.的帶葉莖枝，在我國(guó)南部省區(qū)分布，常寄生于余甘、石榴、柚、山茶、夾竹桃等植物樹(shù)上，有補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨之功效[6]。民間用于治療風(fēng)濕、胃痛、關(guān)節(jié)痛、高血壓、坐骨神經(jīng)痛、腰痛、胎動(dòng)不安、產(chǎn)后乳少等[6]，在我國(guó)云南西雙版納州當(dāng)?shù)鼐用襁€用于治療痛風(fēng)相關(guān)癥狀。

然而，迄今為止，紅花寄生對(duì)治療痛風(fēng)的相關(guān)藥理作用仍未見(jiàn)報(bào)道。本文采用尿酸鈉誘導(dǎo)損傷的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠探究其藥理作用，為尋找用于痛風(fēng)防治的新型中藥以及云南特有民族藥物的研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 動(dòng)物、材料、試劑及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重量180±20 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：SCXK（滇）k2015-0002）；實(shí)驗(yàn)大鼠飼料購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，（合格證號(hào)：SCXK（滇）k2015-0003）。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查合格（R-0620170010）。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，動(dòng)物自由取食，自由飲水。飼養(yǎng)室內(nèi)保持安靜，室內(nèi)溫度維持在23-25℃，濕度55-75%，日光燈照明，每天24 h中保持12 h照明12 h黑暗。

1.2 試劑與材料

紅花寄生樣品采自云南西雙版納州勐?？h，樣品經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院胡海波老師鑒定為桑寄生科植物紅花寄生Scurrula parasitica L.，憑證標(biāo)本保存于昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；苯溴馬隆購(gòu)自江蘇省昆山龍燈瑞迪制藥有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字J20130141，規(guī)格：50 mg·片-1）；微晶型尿酸鈉（MSU）購(gòu)自Sigma公司；吐溫-20（Tween-20）購(gòu)自Biosharp科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）測(cè)定試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-8（IL-8）、黃嘌呤氧化酶（XOD）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；尿酸（UA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制備；其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

T-5000型電子天平（d=0.1 g；常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；BS-224電子天平（d=0.00001 g，北京賽爾利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超聲波清洗機(jī)（14-1275；寧波新芝生物科技股份有限公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；FD5-3型冷凍干燥機(jī)（美國(guó)金西盟國(guó)際集團(tuán)）；TGL-16BS臺(tái)式微量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HR/16M高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海翱藝儀器有限公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紅花寄生提取物制備

將烘干（50℃）后的紅花寄生藥材粉碎，取粉末適量，加8倍量蒸餾水浸泡30 min，煎煮30 min（以煮沸時(shí)開(kāi)始計(jì)算），過(guò)濾，收集濾液；殘?jiān)偌铀蠓?0 min，過(guò)濾，收集濾液；殘?jiān)偌?0倍量80%乙醇加熱回流60 min，過(guò)濾，收集濾液；合并3次濾液，減壓回收溶劑（50℃）；所得浸膏置于-80℃冰箱中結(jié)冰后，轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)中，冷凍干燥得凍干粉。將凍干粉研碎，混勻，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 痛風(fēng)動(dòng)物模型復(fù)制及給藥

2.2.1 分組與給藥

36只大鼠隨機(jī)分6組，分別為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、紅花寄生（高、中、低劑量）組，每組6只；對(duì)照組及模型組給予等體積蒸餾水，陽(yáng)性藥組給予苯溴馬隆4.2 mg·kg-1，紅花寄生高、中、低劑量組分別給予4.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1、1.0 g·kg-1紅花寄生提取物；其中紅花寄生高、中、低劑量組連續(xù)灌胃給藥10天，陽(yáng)性藥組苯溴馬隆連續(xù)灌胃給藥2天，每天灌胃給藥1次，灌胃體積為10 mL·kg-1。

2.2.2 造模

末次給藥1 h后，將模型組、陽(yáng)性藥組及紅花寄生低、中、高劑量組按照Mc Carty DJ經(jīng)典方法開(kāi)始造模[7]：即用酒精局部消毒，將1 mL滅菌注射針于受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)從45°方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將0.05 mL尿酸鈉溶液（取0.5 g MSU，充分研細(xì)，加入9 mL生理鹽水和1 mL吐溫-80，加熱攪拌溶解即得）注入到踝關(guān)節(jié)腔造模，正常對(duì)照組注射0.05 mL無(wú)菌生理鹽水。

2.3 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 裸關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定

每組大鼠分別于造模后0、2、4、8、12、24、48、72、96 h，采用傅線法測(cè)量右側(cè)踝關(guān)節(jié)同一部位周長(zhǎng)，每只測(cè)3次，取平均值。

圖1 注射MSU 24 h后各組大鼠踝關(guān)節(jié)及足趾

表1 紅花寄生提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響

表1 紅花寄生提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

造模后踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)/cm劑量/(g·kg-1)——0.0042 4.0 2.0 1.0組別對(duì)照組模型組陽(yáng)性組高劑量組中劑量組低劑量組造模前踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)/cm 2.18±0.04 2.28±0.07 2.27±0.07 2.14±0.06 2.23±0.08 2.23±0.05 2 h 2.21±0.09***2.77±0.14 2.47±0.08 2.70±0.08 2.70±0.05 2.72±0.09 4 h 2.45±0.13**2.80±0.19 2.78±0.10 2.64±0.11 2.63±0.10 2.69±0.06**8 h 2.47±0.13**2.84±0.08 2.79±0.17 2.89±0.13 2.81±0.11 2.78±0.11**12 h 2.46±0.08**2.84±0.14 2.81±0.08 2.89±0.13**2.74±0.21*2.87±0.14 96 h 2.46±0.07*2.64±0.10 2.57±0.06*2.53±0.15 2.41±0.12*2.52±0.11 24 h 2.42±0.10*2.70±0.07 2.65±0.14 2.87±0.08***2.79±0.15*2.74±0.11 48 h 2.53±0.09*2.82±0.13 2.77±0.07 2.77±0.15 2.69±0.09*2.69±0.12 72 h 2.58±0.11*2.68±0.09 2.55±0.06*2.65±0.07 2.60±0.08*2.65±0.12

2.3.2 血樣分析

于造模后96 h，用3.5%水合氯醛（0.1 mL·10 g-1）將大鼠麻醉解剖后，肝門(mén)靜脈取血4-5 mL，于4000 r·min-1，常溫離心10 min，分離出血清，按各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定血清中IL-1β、IL-8、TNF-α、XOD及UA水平。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 紅花寄生提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響

如圖1所示，在踝關(guān)節(jié)腔及足趾皮下注射MSU造模24 h后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)及足趾出現(xiàn)顯著紅腫和功能障礙（不能正常行走）；給予苯溴馬隆后，紅腫和功能障礙明顯減輕，雖與對(duì)照組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)相比仍有些腫脹，但整體趨近于對(duì)照組；同苯溴馬隆一樣，給予紅花寄生提取物后，紅腫和功能障礙均有一定程度減輕，雖與對(duì)照組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)比較仍有腫脹，但趨近于對(duì)照組，尤以中劑量組改善作用明顯。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可有效減輕MSU造成的大鼠踝關(guān)節(jié)及足趾紅腫，并能改善功能障礙。

寄生茶提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響（表1），與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠注射MSU后2 h，關(guān)節(jié)及足趾開(kāi)始出現(xiàn)紅腫和功能障礙，發(fā)生率為100%，踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，P ＜ 0.001），8-48 h達(dá)高峰期，在48 h后開(kāi)始逐步消退。與模型組比較，苯溴馬隆組在72 h后可顯著降低大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)（P＜0.05）；紅花寄生高、中、低劑量組在4-96 h的不同時(shí)間段均能不同程度降低降低大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可有效降低大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度。

3.2 紅花寄生提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影響（表2）

與正常對(duì)照組相比，大鼠造模后血清中IL-1β、IL-8和TNF-α含量均有明顯升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），提示MSU導(dǎo)致炎癥因子釋放，炎癥發(fā)生。與模型組相比，紅花寄生中劑量組和苯溴馬隆組能顯著降低血清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量（P ＜0.05，P ＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可抑制MSU導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)而緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

3.3 紅花寄生提取物對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清尿酸、黃嘌呤氧化酶的影響（表3）

經(jīng)MSU溶液注射后，模型組大鼠血UA濃度顯著升高（P＜0.001），且模型組大鼠XOD活性明顯增加（P＜0.01），提示大鼠體內(nèi)嘌呤及尿酸代謝紊亂。與模型組比較，紅花寄生高、低劑量組和陽(yáng)性藥組均能明顯降低血UA水平（P ＜0.05，P ＜0.01），紅花寄生高、中、低劑量組和陽(yáng)性藥組均能降低XOD活性（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可有效降低XOD活性及血清UA含量而緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

表2 紅花寄生提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影響（,n=6）

表2 紅花寄生提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影響（,n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001。

TNF-α/(pg·mL-1)28.07±1.27***36.47±1.38 33.96±0.50*35.87±0.76 33.74±0.64*35.58±1.41組別對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組紅花寄生高劑量組紅花寄生中劑量組紅花寄生低劑量組劑量/(g·kg-1)— —0.0042 4.0 2.0 1.0 IL-1β/(pg·mL-1)234.94±13.03**382.94±18.40 224.17±12.65**340.26±18.73 151.99±14.31***309.57±16.10 IL-8/(ng·L-1)72.89±1.74*80.93±1.01 68.11±0.45**85.74±2.70 72.92±2.58*82.13±0.51

表3 紅花寄生提取物對(duì)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中UA、XOD的影響（s,n=6）

表3 紅花寄生提取物對(duì)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中UA、XOD的影響（s,n=6）

注：與模型組比較，P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

XOD/U/L 5.24±0.66**8.47±0.31 5.58±0.58**4.02±0.29***5.39±0.56**6.61±0.46*組別對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組紅花寄生高劑量組紅花寄生中劑量組紅花寄生低劑量組劑量/(g·kg-1)— —0.0042 4.0 2.0 1.0 UA/(μmol·L-1)21.43±4.41***52.56±2.44 39.76±2.82*28.94±2.08**46.12±3.43 29.86±5.69**

4 討論

痛風(fēng)是MSU由沉積在關(guān)節(jié)周?chē)鸬囊环N炎癥，臨床以關(guān)節(jié)劇痛伴腫脹發(fā)熱暗紅為主要表現(xiàn)。MSU注射踝關(guān)節(jié)腔后可致大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，受試關(guān)節(jié)周徑明顯增大，腫脹嚴(yán)重，正常行走步態(tài)明顯改變[8]。因此，本文采用MSU誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型（Mc Carty DJ經(jīng)典造模方法），并以苯溴馬隆為陽(yáng)性藥（可抑制腎小管對(duì)尿酸的再吸收而降低血中尿酸，進(jìn)而緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[9]）探討紅花寄生提取物對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)作用。研究表明，小鼠雌雄動(dòng)物之間血清UA正常值差異較大[10]，故本文僅選用雄鼠。

痛風(fēng)最典型的臨床癥狀是突發(fā)性足趾關(guān)節(jié)的紅、腫、劇烈疼痛等一系列急性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)[11,12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU后，大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度顯著增加，而紅花寄生提取物高、中、低劑量組能在不同時(shí)段不同程度抑制其大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），說(shuō)明紅花寄生可有效緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心是中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥，增強(qiáng)的中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏連是急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)，炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α等在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的免疫和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。研究表明，抗TNF-α能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的激活和中性粒細(xì)胞募集，從而抑制炎癥反應(yīng)，降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)組織局部IL-1β、IL-8和TNF-α水平，可能終止炎性細(xì)胞因子的惡性循環(huán)[13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，MSU可顯著增加IL-1β、TNF-α及IL-8水平，而中劑量紅花寄生提取物能顯著降低這些炎癥因子的水平（P＜0.05，P＜0.001），表明紅花寄生可有效抑制MSU引發(fā)的炎癥反應(yīng)而緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

XOD是體內(nèi)催化黃嘌呤、次黃嘌呤氧化生成尿酸的酶，而血UA升高是痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)，二者均是痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展的體內(nèi)重要標(biāo)志物[14]。本研究表明，MSU顯著升高XOD活力，且血UA也隨之顯著升高；而給予低、高劑量紅花寄生提取物后，二者水平均顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.01，P＜0.001），且其高劑量的效果優(yōu)于苯溴馬隆。說(shuō)明紅花寄生可有效抑制XOD活力，降低血UA而緩解MSU誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

綜上所述，紅花寄生可緩解MSU誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)癥狀。其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)，抑制XOD活力及促進(jìn)UA排泄有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)，本研究選取的紅花寄生高、中、低三個(gè)劑量的藥效指標(biāo)與劑量沒(méi)有成明顯劑量依賴關(guān)系，這可能是由于天然藥物中復(fù)雜的化學(xué)成分及復(fù)雜作用機(jī)制（多途徑、多靶點(diǎn)及疊加等方式整合作用）導(dǎo)致的，且這種非線性特點(diǎn)亦存在其他天然產(chǎn)物中[15]；也可能是本研究給藥劑量沒(méi)有在能體現(xiàn)劑量依賴關(guān)系的劑量范圍內(nèi)。本研究結(jié)果可為紅花寄生臨床應(yīng)用、資源開(kāi)發(fā)及創(chuàng)新藥品/健康產(chǎn)品研發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為深入探討紅花寄生 緩解痛風(fēng)的作用機(jī)制夯實(shí)基礎(chǔ)。