填精通絡(luò)方及其拆方對糖尿病性勃起功能障礙大鼠的性激素及陰莖海綿體eNOS酶表達的影響＊

商建偉，盛 文，李憲銳，穆 俊，于旭東，柳紅芳

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 北京 100700；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 長沙 410208；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 北京 100123）

1 研究背景

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED）是最常見的一種男性性功能疾病，指陰莖持續(xù)不能達到和（或）維持足夠的勃起以完成滿意滿意性生活，是目前眾多男性非常關(guān)心的問題[1],而糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）人群中并發(fā)ED的概率是普通人的2-3倍[2,3]，且臨床癥狀更為嚴重[4]，在60周歲以上的中老年DM患者中，ED的發(fā)病率甚至可達到95%以上[5]。研究表明，DM是引起勃起功能障礙的最重要器質(zhì)性疾病之一，DM并發(fā)ED的概率是非DM患者的3倍（分別為49.3%和15.6%）[6]。DM病程延長和其他血管神經(jīng)并發(fā)癥的出現(xiàn)而升高[7]、ED發(fā)病率隨年齡增長而不斷增加。

DM屬于中醫(yī)“消渴病”的范疇；勃起功能障礙屬中醫(yī)“陽痿”、“陰痿”范疇。DM并發(fā)ED即中醫(yī)學(xué)的消渴合并陽痿。在消渴病的發(fā)展進程中，消渴日久，則必然發(fā)展為下消，導(dǎo)致腎精虧虛；腎虛日久，則元氣虧虛、精血耗傷，無力推行氣血，血瘀脈絡(luò)是導(dǎo)致消渴并發(fā)陽痿的重要基礎(chǔ)。因此，腎精虧虛、血瘀脈絡(luò)是糖尿病性勃起功能障礙的根本病機[8]。本實驗采用DMED大鼠模型，觀察填精通絡(luò)方及其拆方對生殖激素和陰莖海綿體結(jié)構(gòu)的影響，探討其治療糖尿病性勃起功能障礙可能的作用機制。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

SPF級成年雄性SD大鼠60只（8周齡，體質(zhì)量230±50 g）購自北京維通利華驗動物科技有限公司（合格證號NO.SYXK（京）2012-0001，北京，中國）。大鼠在標準的實驗室條件下飼養(yǎng)，提供標準食物和水。北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動物與人類倫理委員會批準了這項研究。

2.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素（STZ）、阿撲嗎啡(APO)、檸檬酸鈉和檸檬酸購自美國sigma公司；血糖儀及試紙購自美國強生公司；大鼠睪酮（T）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）ELISA檢測試劑盒購自中生北控股份有限公司；eNOS、p-eNOS兔抗大鼠一抗(Cell signaling公司，美國)；脫水機（Leica TP1020）—上海徠卡儀器有限公司、包埋機（KD-BM）—浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司、凍臺（JB-L5）—武漢俊杰電子有限公司、切片機（RM2016）—上海徠卡儀器有限公司、攤片機（KDP）—浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司、烘箱（DHG-9077A）—上海精宏實驗設(shè)備有限公司、光學(xué)顯微鏡（XSP-C204）—重慶光電儀器有限公司。

2.3 中藥的制備

所有中藥顆粒都來自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院（中國北京）。填精通絡(luò)方顆粒由以下成分組成：淫羊藿15 g，熟地黃10 g，水蛭10 g，川牛膝10 g；填精方由淫羊藿15 g，熟地黃10 g組成；通絡(luò)方由水蛭10 g，川牛膝10 g組成。將顆粒溶于蒸餾水中，并在2-8℃儲存直至進一步使用。

2.4 DMED大鼠分組與模型

將成模大鼠隨機分為正常組、模型組、對照組、填精通絡(luò)組、填精組及通絡(luò)組，每組10只。模型組、對照組、填精組、通絡(luò)組及填精通絡(luò)組大鼠建立DMED大鼠模型。將1 g STZ溶解在100 mL檸檬酸鈉-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 4.5）中以達到最終濃度為10 mg·mL-1，在冰上操作并避光保存。禁食12小時后，以50 mg·kg-1劑量腹腔注射STZ溶液在右下腹。在STZ注射后72小時，1周和2周各從大鼠的尾靜脈抽血測試血糖。每次的隨機血糖＞16.7 mmol·L-1，尿量增加和飲食增加是成功DM大鼠模型的標志。

根據(jù)Heaton的方法[9]，將DM大鼠稱重并放置在透明的玻璃箱中，光線暗到僅供觀察，房間保持安靜。在適應(yīng)環(huán)境15分鐘后，每只大鼠在頸部皮膚松弛處注射APO100 μg·kg-1并觀察30分鐘。陰莖增大，包皮回縮，龜頭陰莖充血，陰莖末端出現(xiàn)稱為陰莖勃起。如果勃起次數(shù)≥1，則認為勃起試驗陽性。血糖＞16.7 mmol·L-1且勃起試驗陰性的大鼠為DMED造模成功。

2.5 實驗方法

造模成功后，正常組及模型組每日灌胃等體積的蒸餾水，對照組予以0.2 mg·kg-1他達拉非灌胃，每周兩次；填精通絡(luò)組予以填精通絡(luò)方以9.3(g·kg-1)·d-1灌胃，填精組予以拆方Ⅰ號以7.2(g·kg-1)·d-1灌胃，通絡(luò)組予以拆方Ⅱ號以2.1(g·kg-1)·d-1灌胃，正常組與模型組分別灌服等體積蒸餾水，連續(xù)30天。

2.6 指標檢測及方法

①大鼠血糖檢測：采用大鼠尾部取血的方式取血，使用便攜式血糖儀檢測各組大鼠治療前后的血糖水平；②大鼠性激素檢測：大鼠以10%的水合氯醛按3 mL·kg-1體重比腹腔注射進行麻醉，麻醉后采腹主動脈血，離心后取上層血清，用酶聯(lián)免疫分析法測定各組大鼠的大鼠睪酮（T）、黃體生成素（LH）、促卵泡素（FSH）等性激素水平的差異；③取1 cm陰莖組織石蠟包埋切片，進行eNOS的免疫熒光染色。400倍光鏡下采集圖像，利用圖像分析軟件（Image-ProPlus 6.0）來分析熒光吸光度。

2.7 統(tǒng)計分析

所有來自本研究的計量數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果表示為平均值±標準偏差。在滿足正態(tài)分布條件下，各組間采用獨立樣本t檢驗；不滿足正態(tài)分布情況下，若滿足方差齊性，則使用單因素方差分析（ANOVA）分析組間差異，若不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗法，P＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

隨著病程的進展，模型組、對照組、填精組、通路組以及填精通絡(luò)組均出現(xiàn)多飲、多食、多尿、毛失、去光澤、脫毛、活動減少等DM癥狀。而正常組的大鼠毛色光亮順滑，體重增加，好動。

3.2 治療前后大鼠血糖水平差異

實驗結(jié)果表明，填精通絡(luò)方能明顯降低大鼠血糖水平。填精組、通絡(luò)組、填精通絡(luò)組治療后血糖均顯著低于治療前血糖（P＜0.01）。與模型組比較，填精組、通絡(luò)組及填精通絡(luò)組的血糖明顯降低（P＜0.01）；與對照組比較，填精通絡(luò)組的血糖明顯降低（P＜0.01）；與通絡(luò)組比較，填精組和填精通絡(luò)組的血糖明顯降低（P ＜ 0.05）（表1）。

3.3 大鼠性激素水平差異

實驗結(jié)果表明，填精通絡(luò)方能明顯升高大鼠血清T水平。填精組、通絡(luò)組及填精通絡(luò)組的血清T要明顯高于模型組（P＜0.05）；填精通絡(luò)組的血清T含量明顯高于對照組（P＜0.05）；填精通絡(luò)組的血清T含量明顯高于填精組和通絡(luò)組（P＜0.01）。LH與FSH在各組外周血液中濃度均無明顯變化（P＞0.05）（表2）。

3.4 大鼠陰莖海綿體eNOS酶表達情況

大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達主要在陰莖海綿體血管內(nèi)皮細胞及竇狀隙內(nèi)皮細胞的細胞核和細胞漿內(nèi)。利用圖象分析系統(tǒng)來測定每組的eNOS酶的含量多少。實驗結(jié)果表明：填精通絡(luò)方能明顯改善大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況。填精組、通絡(luò)組及填精通絡(luò)組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于模型組（P＜0.01）；填精通絡(luò)組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于對照組（P＜0.05）；通絡(luò)組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于填精組（P＜0.05）；填精通絡(luò)組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于填精組和通絡(luò)組（P＜0.01）（表3）。

3.5 陰莖海綿體病理組織學(xué)結(jié)果

正常組陰莖海綿竇毛細血管豐富，未見明顯的陰莖海綿體間隔，可見大量不規(guī)則血竇間隙，血竇、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、間質(zhì)組織及微血管腔結(jié)構(gòu)清晰，血竇間隙表面附有扁平的內(nèi)皮細胞，血竇小梁含有大量平滑肌細胞及膠原纖維。模型組陰莖海綿體間隔明顯，陰莖海綿體血竇、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞分布雜亂，陰莖海綿體平滑肌細胞數(shù)量減少，血管內(nèi)皮細胞連續(xù)性破壞，膠原纖維密度增加，間質(zhì)組織大量增生、排列紊亂，血管壁增厚，呈纖維樣變，管腔變小或閉塞。其余各組病理變化介于兩者之間（圖1）。

表1 各組大鼠治療前后血糖比較（mmol·L-1，x±s）

表2 大鼠性激素水平差異

表3 大鼠陰莖海綿體eNOS酶表達情況

4 討論

圖1 陰莖海綿體組織病理學(xué)檢測

腎精虧虛、脈絡(luò)瘀阻是DMED最基本病機，治療當(dāng)以補腎活血，填精通絡(luò)為首要。辨證施治時需在補腎活血，填精通絡(luò)的前提下，再根據(jù)不同的證型具體的臨證加減藥物及其用量?！皻鉃檠畮?，血為氣之母?！睔馓搫t難以推動血行，導(dǎo)致氣虛血瘀，脈絡(luò)瘀阻。使得宗筋不得氣血之濡養(yǎng)，則發(fā)為陽痿。所謂“腎虛必致血瘀，瘀血必歸于腎”[10]，是因為血瘀脈絡(luò)而導(dǎo)致腎精化生不暢。所以，DMED在治療上應(yīng)以補腎活血，填精通絡(luò)為主要的治療方法，腎精得補，淤血得散才能使得腎中精氣化生有源，宗筋得以氣血濡養(yǎng)，方能起痿。

臨床上我們發(fā)現(xiàn)填精通絡(luò)方在治療DMED上有著良好的效果，不僅能過改善患者勃起功能，還能明顯輔助降低患者血糖。研究表明[11]DMED的嚴重情況和血糖控制情況是密切的，DMED的治療是以控制血糖為基礎(chǔ)的，防止糖尿病對血管、神經(jīng)的進一步損害。本實驗結(jié)果表明，填精組、通絡(luò)組、填精通絡(luò)組治療后血糖均顯著低于治療前血糖，尤其是填精通絡(luò)組最為明顯，但不管何組，血糖降低的幅度并不大，可見在治療DM的時候，還是其他輔助方式來治療DM。

T是一種類固醇類雄激素，主要由睪丸間質(zhì)細胞分泌。T能通過提高男性性欲[12]、激活一化氮合酶[13]、降低陰莖海綿體血管收縮[14]等方面來刺激陰莖的勃起及維持。臨床上我們也發(fā)現(xiàn)DM患者血清T水平偏低，補充一定量的T也有助于改善患者的勃起功能。本實驗結(jié)果表明，填精組、通絡(luò)組及填精通絡(luò)組的血清T要明顯高于模型組，尤其是填精通絡(luò)組，雖然仍不及正常組，但是改善效果依然明顯，但各組中LH與FSH在各組外周血液中濃度均無明顯變化，我們分析可能的原因是填精通絡(luò)方能通過改善T產(chǎn)生的環(huán)境從而升高血清T水平，但填精通絡(luò)方對于垂體分泌的FSH與LH卻沒有明顯的影響。

陰莖勃起是在機體神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控下陰莖海綿體血管活動的過程，海綿體內(nèi)神經(jīng)末梢及海綿竇內(nèi)皮細胞在eNOS酶的作用下合成并釋放一氧化氮(nitric oxide,eNOS),進而導(dǎo)致陰莖海綿體血管平滑肌舒張，大量血流進入海綿體組織，從而導(dǎo)致海綿體內(nèi)壓升高完成勃起過程[15]。本實驗結(jié)果表明：填精通絡(luò)方能明顯改善大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況；填精組、通絡(luò)組及填精通絡(luò)組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于模型組，尤其是以填精通絡(luò)組最為明顯，而對照組陰莖海綿體eNOS酶的表達情況要高于填精組和通絡(luò)組，說明他達拉非能明顯改善陰莖海綿體eNOS酶的表達情況，這也是他達拉非治療ED的具體機制之一；而填精通絡(luò)組的改善優(yōu)于對照組，但是仍低于正常組,說明填精通絡(luò)組在治療DMED方面,治療方案還有待進一步的改善。