藥用植物箭葉淫羊藿EsMIXTA基因的克隆及其表達分析＊

李 明，孫 偉

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥學部 北京 100070；2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100070）

1 前言

植物的表皮毛（trichomes）是植物葉片和其他器官的表面突起。植物的表皮毛通常被稱為腺毛是植物重要的保護組織及次生代謝產(chǎn)物分泌的場所。腺毛可以通過分泌特定的物質(zhì)從而對抗侵蝕者、微生物的侵擾。從形態(tài)學上可以把表皮毛劃分為兩類細胞分別是單細胞非腺性的，一類是多細胞的腺性的[1]。有些植物可能只具有一類腺毛類型，但大多數(shù)植物往往兼有兩種腺毛類型。植物各個器官表皮分布著由角質(zhì)層和疏水的蠟質(zhì)層組成的化學物質(zhì)，它們可以有效的增加植物的表皮機械力，同時由于不同組織間角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的比例不一樣，其各個器官的屬性也就有著較大的區(qū)別。從通過分子生物學手段對模式植物擬南芥研究后發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的glassy hair 6(glh6)和ATP-binding cassette G family member 11(abcg11)等基因也參與著表皮角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的生物合成。從調(diào)控角度上講，擬南芥的表皮毛發(fā)育同根毛發(fā)育具有相同的機制，大部分由MYB-bHLH-WD40轉錄復合體調(diào)控著表皮毛的形成和分化[2]。同時細胞內(nèi)的離子通道、細胞骨架、微管和微絲的分布也在調(diào)控著表皮毛的發(fā)育。MYB轉錄因子是植物中成員龐大的基因家族之一[3,4]。在這其中R2R3類MYB基因則是整個MYB基因家族成員最多，這類蛋白擁有兩個MYB repeat結構域，因為被命名為R2R3 MYB。R2R3 MYB基因家族成員在越來越多的物種有所報道，比如其中擬南芥中已發(fā)現(xiàn)超過198個MYB家族基因，而在棉花基因組中有200個MYB基因。功能研究表明，MYB類轉錄因子參與了植物次生代謝物質(zhì)的調(diào)控、植物激素和環(huán)境因子應答，同時在植物器官發(fā)育角度上看MYB基因在植物細胞的分化、細胞周期調(diào)控以及葉片等器官形態(tài)建成起到重要的作用。其中的group 9類主要負責表皮細胞的形成和分化。這類基因最早是在金魚草中報道的，它調(diào)控著金魚草花瓣表皮柱狀細胞的形成[5]。同時在金魚草中也同時存在著MIXTA基因的旁系同源基因即MIXTA-LIKE 1、MIXTA-LIKE 2和MIXTA-LIKE 3，他們都在金魚草花表皮細胞突起的形成過程中起到了關鍵性的作用，但是它們的功能并不冗余[6]。除了金魚草外，MIXTA基因控制植物表皮發(fā)育的功能已經(jīng)在大量植物中進行了克隆及功能驗證，他們包括楊樹、矮牽牛及樹石斛等[7-9]。在擬南芥中AtMYB106和AtMYB16通過不同的方式調(diào)控著擬南芥表皮毛的發(fā)育，其中AtMYB106和APETALA2/ETHYLENERESPONSE FACTOR(AP2/ERF),WAXES INDUCER1/SHINE1一起調(diào)控著擬南芥的角質(zhì)層形成，從而控制著擬南芥表皮毛的分布。最近通過群體遺傳學及二代測序技術相結合生物信息學分析方法對猴面花得EMS突變體進行BSA（Bulk segregation analysis）群體分析后，也闡明了一個和蜜腺發(fā)育相關的MIXTA基因[10]。針對藥用植物表皮毛發(fā)育研究直接關系到藥用成分的合成以及分泌，通過對黃花蒿的表皮毛轉錄組數(shù)據(jù)庫的深入研究，一個名為AaMIXTA1的R2，R3-MYB類的轉錄因子基因被成功克隆。通過超表達及RNAi實驗證明，AaMIXTA1基因可以有效控制青蒿素的合成，這是由于其可以控制黃花蒿葉片表皮毛外表皮蠟質(zhì)合成基因的表達。通過轉基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)超表達AaMIXTA基因的黃花蒿品系并未使黃花蒿的表皮毛形態(tài)發(fā)生異形改變，同時又提高了青蒿素的含量，這為轉基因育種提供了更好的研究思路[11]。從基部真雙子葉植物唐松草中克隆得到的MIXTA-like2基因可以使轉基因煙草的表皮突起增加,驗證了唐松草中MIXTA-like2基因的功能[12]。

淫羊藿為中國傳統(tǒng)中草藥之一，具有2000多年的悠久歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，淫羊藿有“主陰痿絕傷，莖中痛，利小便，益氣力，強志”的功效。《日華子本草》則稱淫羊藿“能治一切風冷勞氣，補腰膝，強心力，丈夫絕陽不起，女子絕陰無子。筋骨攣急。四肢不任，老人昏耄，中年健忘”。它不僅具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效，而且還兼有抗衰老、改善免疫功能、抑制腫瘤和抗骨質(zhì)疏松等功效，其有效成份主要為黃酮醇苷類物質(zhì)。針對淫羊藿所開展的調(diào)控研究已經(jīng)在MYB類型的基因有所報道，比如EsMYBA1基因和EsAN2可以調(diào)控花青素的生成[13]，EsMYBF1可以調(diào)控黃酮醇的形成[14]，EsMYB9基因可以同時調(diào)控花青素和黃酮醇的形成[15]。

淫羊藿的花被從外至內(nèi)分別稱之為外萼片、內(nèi)萼片和花瓣（距）。外萼片通常為紫色或綠色；外一對較小，卵狀長圓形；內(nèi)一對較大，卵形或闊卵形，有時具白色邊。由于該屬外萼片較小，早落，種間差別不大，一般不作為分種的依據(jù)。內(nèi)萼片花瓣狀，水平展開或略反折，呈三角形、卵形、寬卵形或披針形；花瓣的形態(tài)也比較多樣化，呈瓣片狀、具長距、具短距或囊狀等。內(nèi)萼片形態(tài)、花瓣（距）的形態(tài)及與二者的大小關系是最穩(wěn)定的形態(tài)性狀，在屬下分組和分種中具有重要的意義。本項研究以藥用植物箭葉淫羊藿作為研究對象，參考本草基因組的方法體系[16,17]，通過同源克隆的研究策略成功地對控制表皮毛發(fā)育相關基因EsMIXTA進行克隆及表達分析，為以后通過基因工程改造箭葉淫羊藿表皮發(fā)育，提高次生代謝產(chǎn)物的合成提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與實驗試劑

大腸桿菌（Escherich coli）DH5α菌株感受態(tài)細胞購買于全式金公司。Trizol RNA提取試劑及反轉酶Superscript III購自于英偉創(chuàng)津公司（Invitrogen，China）；瓊脂糖凝膠試劑盒購自于天根公司（Tiangen，China）；ExTaq酶、pMD19-T載體及熒光實時定量PCR試劑購自于購自于寶生物公司（Takara，Japan）。

2.2 RNA提取及cDNA第一條鏈合成

取箭葉淫羊藿的根、葉和花，在180-200℃烘烤過的研缽中用液氮將其充分研磨，迅速倒入無RNA酶的離心管中，待液氮揮發(fā)后，按1 mL試劑/100 mg材料的比例加入適量的Trizol反應試劑（Invitrogen公司），并按照Trizol試劑盒的說明書進行RNA的提取?；?′端 獲 得 的 cDNA 合 成 以 3′CDS:5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′為引物，而 5’端獲得的cDNA合成初始則需以引物5′CDS:和SMART II A oligo 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3作為反轉錄引物，反轉錄過程參考Superscript III反轉錄酶說明書。

2.3 EsMIXTA基因的克隆

根據(jù)已有報道的唐松草中的MIXTA基因且簡并引物作為正向引物[12]，以 UPM1:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′和 UPM2：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′引物作為反向引物進行EsMIXTA基因的3′端克隆。反應體系：以2 μL的第一鏈cDNA為模板；2 μL正、反向引物（UPM）（10 μM）；5 μL 10×PCR 緩沖液；2 μL dNTP（2mM）；1 U ExTaq DNA聚合酶；用無菌去離子水將體系補至50 μL。PCR反應條件：94℃變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，10個循環(huán)；每個循環(huán)減一度。94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán)；72℃延伸10 min。結果檢測：取PCR產(chǎn)物5 μL，電泳檢測，切膠回收，連接載體轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆進行測序。在獲得正確的EsMIXTA基因的3′端后，以該序列作為候選序列，設計基因5′端的反向引物。EsMIXTA基因5′端的獲得；反應體系同3′端基因的獲得，正向引物為UPM（10 μM）；反向引物為基因特異性引物。對EsMIXTA基因5′端及3′端進行分析后設計全長引物EsMIXTAFULF:ATGGGTCGATCACCGTGTGAT和EsMIXTAFULR:CAGGAGAACGGGAGGGAGAA。

2.4 連接產(chǎn)物的轉化

從-80℃超低溫冰箱中取出感受態(tài)細胞，放在冰上，加入5 μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30 min。將含有感受態(tài)細胞和連接產(chǎn)物的離心管置于42℃恒溫水浴鍋中，熱激60 s，不要搖晃。然后，立即冰浴2 min。加入750 μL LB培養(yǎng)基，混勻，置于37℃搖床上，約150 rpm，培養(yǎng)45-60 min。4000 rpm，離心5 min。在含氨芐青霉素的 LB 平板上涂上 X-Gal（20mg·mL）40 μL，晾干。從離心后的離心管中吸去500 μL上清后，用剩余的上清液將菌體混勻，并加入IPTG（200mg/ml）20μl，涂于LB平板上。將平板于37℃培養(yǎng)12-16h。

2.5 EsMIXTA基因的表達模式

以箭葉淫羊藿根、葉、萼片、花瓣及雄蕊雌蕊混合材料為研究對象，用Trizol試劑盒提取總RNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Takara,Japan)進行，第一鏈cDNA的反轉錄。在進行PCR反應前，將第一鏈cDNA稀釋10倍作為模板。然后利用SYBR?Premix Ex TaqTM II(Takara,Japan)反應試劑盒，在型號為ABI7500的實時定量PCR儀上以引物EsMIXTRTF:5′-TAACGGAGCAGTCGAAAAGTGA-3′EsMIXTR:5′-CGGTGTCTCCACTACCGTCTG-3′來完成反應,并根據(jù)雙標準曲線法利用ABI7500軟件（基因有限公司）分析所獲得的數(shù)據(jù)并計算樣品中目的基因濃度。本實驗所用的PCR反應體系為20 μL，共設置3個重復，反應條件為40個循環(huán)，95°5 s、60°34 s。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

序列經(jīng)過EMBL網(wǎng)站MUSCLE在線軟件進行比對，之后再通過Modeltest進行最大似然法參數(shù)選擇計算，最終運用MEGA 5.0中進行最大似然樹（Maximum Likelihood）的構建，自舉檢驗（bootstrapvalue）為1000次。

2.7 花萼片和花瓣表面的掃描電鏡觀察

收集箭葉淫羊藿花萼片和花瓣立即進行固定和處理材料，其中固定液為FAA或者戊二醛。將固定至少24小時以上的材料，經(jīng)不同濃度乙醇梯度脫水后轉入95%乙醇中，過夜。脫水：將剝出的材料轉入無水乙醇中，脫水20 min。此后，將材料相繼轉入75%乙醇+25%乙酸異戊酯；50%乙醇+50%乙酸異戊酯；25%乙醇+75%乙酸異戊酯；100%乙酸異戊酯中，每級20 min。二氧化碳臨界點干燥。將干燥好的原基材料在解剖鏡下用雙面膠粘在金屬臺上。在離子濺射儀上對粘好的金屬臺進行噴金、鍍膜。掃描電鏡下觀察照相。

3 結果與分析

3.1 箭葉淫羊藿EsMIXTA基因的克隆與序列分析

經(jīng)克隆后測序獲得EsMIXTA基因的全長，經(jīng)過ORF search預測其開放閱讀框長度為1163bp。經(jīng)過對EsMIXTA基因所編碼蛋白進行Blastp的比對后發(fā)現(xiàn)，EsMIXTA蛋白和唐松草Thalictrum thalictroide MIXTA基因MYBML2蛋白具有最大的相似度。通過對EsMIXTA蛋白與已有的MIXTA蛋白進行比對后發(fā)現(xiàn)EsMIXTA蛋白具有典型的R2 R3-MYB蛋白的結構域，即N端含有典型的結構域R2結構域和R3結構域，并擁有subgroup9的專屬結構域（圖1）。在對MIXTA基因通過核苷酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹重建后發(fā)現(xiàn)，EsMIXTA基因與唐松草中的MIXTA基因親緣關系較近（表1，圖2），由于唐松草屬和淫羊藿屬都隸屬于毛茛目，所以其基因的親緣關系較近符合進化生物學觀點。

3.2 EsMIXTA基因在不同組織中的表達分析

實時定量PCR的結果顯示EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿的根、葉及其花器官中均有一定的表達，其中根中EsMIXTA基因的相對表達最高，其次是葉片，相比根部和葉片，在花器官中該基因的表達明顯低（圖3）。

圖1 箭葉淫羊藿MIXTA基因編碼蛋白氨基酸與其他植物同源基因比對

表1 MIXTA類基因系統(tǒng)發(fā)育樹數(shù)據(jù)

通過對箭葉淫羊藿的花瓣狀萼片和花瓣的上下軸面進行觀察，我們可以觀察到花萼片的上軸面具有明顯的凸起（圖4a），而花瓣的上軸面凸起并不明顯（圖4b）。從下軸面來看，花萼片的下軸面呈現(xiàn)出不規(guī)則的條紋狀突起（圖4c），而花瓣的下軸面則與上軸面形態(tài)類似即矩形微突起（圖4d）。

圖2 通過ML（最大似然）算法對MIXTA類基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹重建

4 討論

在本項研究中，我們通過反向遺傳學的手段在中藥箭葉淫羊藿中克隆得到了一個MYB基因，通過蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，它含有保守氨基酸序列R2和R3兩個區(qū)域。同時該基因所編碼的蛋白質(zhì)擁有特殊性的subgroup9類MYB特有的保守氨基酸基序，從而可以認定該基因?qū)儆趕ubgroup9類型的R2R3 MYB基因。從植物分子系統(tǒng)學角度看箭葉淫羊藿中的MIXTA基因和唐松草MIXTA基因聚成一支，它們都是basal core eudicot（基部真雙子葉類型）物種，所以從進化角度上講，EsMIXTA基因為TtMIXTA基因的直系同源基因。。

圖3 EsMIXTA基因在不同器官中的表達模式

圖4 箭葉淫羊藿萼片和花瓣上下軸面微形態(tài)。

從形態(tài)學角度來觀察，箭葉淫羊藿的萼片上表面表現(xiàn)出不規(guī)則的突起狀態(tài)，這一形態(tài)特征明顯大于花瓣上表面的細胞形態(tài)。由于箭葉淫羊藿的萼片呈現(xiàn)出大、且花瓣狀的形態(tài)，而花瓣則呈現(xiàn)出囊狀的形態(tài)。這一類淫羊藿明顯不同于像巫山淫羊藿等長距類型，我們認為箭葉淫羊藿中的萼片可能起到了招引傳粉者的關鍵作用，當然這個假設需要得到繁殖生物學的證據(jù)。從我們的表達數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿的各個器官中都有所表達，這一結果和之前報道過的金魚草[6]、矮牽牛[7]和唐松草[12]的結果類似，這表明EsMIXTA基因很有可能調(diào)控著細胞突起這一形態(tài)特點，使得箭葉淫羊藿的萼片呈現(xiàn)出花瓣狀的形態(tài)。同時我們發(fā)現(xiàn)EsMIXTA基因在根中的表達量高，這可能和根毛形成有著密切的聯(lián)系。深入的研究需要通過本物種的轉基因試驗或者異源表達去驗證EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿中的功能。