不同PRRS弱毒苗免疫血清對FcγRIIb介導(dǎo)ADE效應(yīng)的影響

余建國 曾容愚

（1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江金華 321007；2.天康生物股份有限公司 烏魯木齊 832003）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由PRRSV引起的豬的一種繁殖障礙和呼吸道傳染病。臨床以商品豬表現(xiàn)呼吸障礙，懷孕母豬表現(xiàn)死胎、木乃伊胎、弱胎。該病于1987年在美國首次被報(bào)道[1]，德國、英國、荷蘭、西班牙等歐洲國家相繼報(bào)道了該病的發(fā)生，進(jìn)而在全球的養(yǎng)豬國家暴發(fā)了該病。該病病原為PRRS病毒（PRRSV），荷蘭學(xué)者首次分離到歐洲型PRRSV代表毒株，北美學(xué)者相繼分離到北美型PRRSV代表毒株ATCC-VR2332。郭寶清等于1996年在我國首次分離到該病毒。

抗體依賴性增強(qiáng)作用 （Antibody-dependent enhancement，ADE）是指某些病毒以對應(yīng)特異抗體處理后，病毒復(fù)制或感染能力顯著增強(qiáng)的現(xiàn)象。宿主被病毒感染后，免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。此時(shí)產(chǎn)生的針對病毒表面蛋白的特異性抗體常常可以阻止病毒粘附于宿主細(xì)胞表面，使其失去感染細(xì)胞的能力。然而在有些情況下，抗體在病毒感染過程中卻發(fā)揮相反的作用，它們協(xié)助病毒進(jìn)入靶細(xì)胞，提高感染率，這一現(xiàn)象就是抗體依賴性增強(qiáng)（ADE）作用，在用肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV時(shí)，加入少量血清可顯著提高病毒復(fù)制水平[2]。對藍(lán)耳病病毒的ADE現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)相對較晚，病毒大多表現(xiàn)為嗜好在巨噬細(xì)胞中繁殖和容易引發(fā)宿主的持續(xù)性感染，用常規(guī)疫苗免疫來防控這類具有ADE效應(yīng)的病毒病時(shí)常常難以奏效，一般認(rèn)為：ADE作用是影響PRRS疫苗效果的主要障礙和研發(fā)疫苗必須考慮的主要因素。

ADE現(xiàn)象最早由Hawkes在20世紀(jì)60年代報(bào)道[3]。仇華吉等研究指出，注射亞水平的PRRSV中和血清滴度，比注射中和水平的IgG更容易誘發(fā)豬發(fā)生病毒血癥[4]；田克恭等研究了血清對感染PRRSV的巨噬細(xì)胞中病毒顆粒增殖數(shù)量影響，結(jié)果表明含有亞中和水平PRRS抗體的抗體處理組與PRRS抗體陰性血清處理組相比差異極顯著，即當(dāng)PRRS抗體低水平存在時(shí)，病毒的增殖顯著增強(qiáng)[5]。一般認(rèn)為：Fc受體（FcR）介導(dǎo)的ADE作用被認(rèn)為是最常見的ADE作用機(jī)制[6]。此外，病毒-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物通過與靶細(xì)胞上的CR2作用增強(qiáng)了粘附；病毒粒子上補(bǔ)體成分的沉積有助于病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合；通過FcR或CR，使補(bǔ)體活化產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對靶細(xì)胞產(chǎn)生刺激效應(yīng) （例如增強(qiáng)胞吞作用），抗體或可溶性CD4在中和濃度以下時(shí)可以使gp120活化，促進(jìn)病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合。當(dāng)血清不能完全中和病毒時(shí)，抗原抗體復(fù)合物通過FcγR介導(dǎo)，病毒對宿主細(xì)胞的侵入能力增強(qiáng)，從而表現(xiàn)低抗體水平時(shí)，發(fā)病率增加。

PRRS弱毒苗誘導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE）效應(yīng)，被認(rèn)為是影響疫苗效果的障礙之一。豬群受到PRRSV野生毒株感染后，群體內(nèi)免疫水平參差不齊，不同個(gè)體的ADE差別很大；另外，通過母源抗體獲得對PRRS被動(dòng)免疫的仔豬，一旦抗體水平下降至保護(hù)性水平以下（亞中和水平），PRRSV就會(huì)表現(xiàn)ADE活性，從而增加動(dòng)物感染和發(fā)病的危險(xiǎn)。PRRSV的ADE效應(yīng)與感染細(xì)胞表面的Fc受體（FcγRIIb）介導(dǎo)有關(guān)，楊青原等研究證實(shí)：用 FcγRIIb多抗能夠弱化ADE效應(yīng)[7]。但該研究未確認(rèn)臨床常用疫苗與Fc受體介導(dǎo)的關(guān)聯(lián)性，也未提示不同疫苗抗體在弱化效果中是否存在差異性。

PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，肺泡巨噬細(xì)胞（Pulmonary alveolar macrophage，PAM） 為其天然靶細(xì)胞。本試驗(yàn)擬以三種不同藍(lán)耳病弱毒苗為對象，以PAM細(xì)胞感染為載體，研究不同抗體免疫復(fù)合物對FcγRⅡb受體介導(dǎo)ADE效應(yīng)的影響，并探索其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與試驗(yàn)動(dòng)物 HP-PRRSV田間分離株（ZJ-2014株，TCID50為 105.0/0.1mL）由上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；PRRSV雙陰性25日齡健康仔豬45頭，購自金華某豬場。

1.1.2 疫苗及抗體 HP-PRRS弱毒苗蘭特威（TJM-F92株，北京某公司生產(chǎn)）；藍(lán)克清（R98株，南京某生物技術(shù)公司生產(chǎn)）；藍(lán)定抗（CH-1R株，福建某公司生產(chǎn)，市購）。IgG、兔抗豬IgG、PRRSV特異性抗體 IgG、兔抗豬FcγRⅡ血清，均由上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)微生物研究室惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑 DNTPs、GraphPad Prism5軟件等市購；新生犢牛血清為上海快靈生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PAM細(xì)胞制備 選25日齡健康仔豬，放血致死后無菌摘取豬肺臟，在肺器官側(cè)壁剪開一個(gè)端口，止血鉗夾住端口稍下位置，用含2 000 IU青霉素、鏈霉素的1640營養(yǎng)液清洗肺臟，灌洗時(shí)注入約100 mL1640（以滅菌紗布包裹血管口，以防血液進(jìn)入收集瓶），連續(xù)多次，直至洗出的1640液透明清亮。將灌洗液2 000 r/min離心20 min，用1640液重懸洗滌PAM細(xì)胞2次，最后加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.5 mL/孔，37℃約6 h，棄去未貼壁的細(xì)胞，用DPBS洗板1次，加入新的營養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)2 h后從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，棄掉舊培養(yǎng)液，用PBS輕輕潤洗2次，加入新的RPMI1640完全培養(yǎng)液。以后每24 h更換1次新鮮培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)20 d。

將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，用PBS沖洗2遍后，加入0.25%胰酶消化4 min后加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將細(xì)胞懸液移至15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清，將4℃預(yù)冷的凍存液加入15 mL離心管中，吹打使細(xì)胞重懸于凍存液中，分裝于細(xì)胞凍存管中(1 mL/管)并標(biāo)記，使用前經(jīng)解凍復(fù)蘇備用。

1.2.2 疫苗免疫血清復(fù)合物的制備 將2.68 mg/mL豬 PRRSV陽性 IgG作倍比 （21～24）稀釋后，與200 TCID50/100μL病毒液等體積混合均勻，在37℃孵育60 min，制成三種不同濃度的疫苗免疫復(fù)合物。

1.2.3 不同濃度特異性抗體PRRSV增殖影響試驗(yàn)將上述1.2.2方法中倍比稀釋的三種疫苗血清復(fù)合物接種到PAM 細(xì)胞上，每孔200 μL。并設(shè)置接毒細(xì)胞對照（對照組加陰性血清），接毒細(xì)胞加入200個(gè)TCID50的 PRRSV（ZJ-2014 株）病毒液 200 μL。每個(gè)稀釋度做3孔平行對照。37℃吸附1 h后棄去上清，用滅菌PBS液漂洗1次，而后加入含10%血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，0.5 mL/孔，5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。補(bǔ)加含10%新生牛血清的RPMI1640細(xì)胞營養(yǎng)液各0.3 mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，-20℃凍存。裂解PAM細(xì)胞后提取細(xì)胞RNA，用段二珍等建立的PRRSV實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法，檢測PRRSV拷貝數(shù)[8]。

1.2.4 PRRSV在不同時(shí)間段的增殖 將濃度為1.30 mg/mL的三種疫苗血清免疫復(fù)合物分別處理PAM細(xì)胞，并設(shè)置接毒細(xì)胞對照（對照組以陰性血清處理PAM細(xì)胞），接毒細(xì)胞加入200個(gè)TCID50的PRRSV（ZJ-2014 株）病毒液 200 μL。

1.2.5 FcγRⅡb多抗阻斷Fc介導(dǎo)ADE作用試驗(yàn)用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基將PAM細(xì)胞稀釋至106個(gè)/mL，按500 μL/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁牢固，吸去培養(yǎng)基，用無菌PBS輕輕漂洗2次。向試驗(yàn)組每孔加入1：100倍稀釋的兔抗豬FcγRⅡ血清 （經(jīng)56℃、30 min以消除補(bǔ)體作用，其余孔加無血清1640培養(yǎng)液，500 uL/孔，37℃下作用1 h后倒掉血清和培養(yǎng)基，用PRRSV（ZJ-2014株）病毒 104.8TCID50與 1：128稀釋的抗 PRRSV陽性血清混合（每種疫苗血清做三個(gè)平行對照），37℃下孵育1 h，加入細(xì)胞板中，每孔500 uL。

設(shè)病毒感染對照，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 1 h后，棄掉病毒與抗體復(fù)合物，加入含2%新生牛血清的培養(yǎng)基作為維持液。感染24 h后收毒，用PAM細(xì)胞測定病毒的TCID50，計(jì)算收獲病毒量的差異，檢測兔抗豬FcγRⅡ血清對ADE的阻斷效果。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 PRRSV拷貝數(shù)通過建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行進(jìn)行絕對定量檢測。數(shù)據(jù)運(yùn)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度疫苗血清對PRRSV增殖的影響 以PRRSV實(shí)時(shí)定量PCR方法，分別檢測感染各組PRRSV的RNA水平。參照說明書推薦的25 μL反應(yīng)體系：SYBRPremix Ex Taq （Tli RNaseH Plus）12.5 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各 0.5 μL、cDNA 2 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。 每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，并選擇3孔不加樣品只加水作為陰性對照。各管充分混勻置于Eppendorf Mastercycler ep realplex 4熒光定量PCR儀中。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。mRNA的相對表達(dá)水平采用2-△△Ct計(jì)算分析。

當(dāng)免疫復(fù)合物作1：4稀釋時(shí)，PRRSV在PAM細(xì)胞中的增殖數(shù)量明顯增多，當(dāng)濃度為0.68 g/L時(shí)，PRRSV增殖速度比純病毒感染PAM細(xì)胞顯著提高，病毒含量相差約20.5倍。試驗(yàn)提示：一定濃度的疫苗抗體能夠顯著增強(qiáng)PRRSV的增殖（見圖1）。

2.2 PRRSV在不同時(shí)間段的增殖情況 同一稀釋度下 （0.68 g/L），疫苗免疫復(fù)合物在PRRSV感染PAM 細(xì)胞的不同時(shí)間（12、24、36 、48 h）內(nèi)，能促進(jìn)PRRSV的增殖，在感染48 h時(shí)PAM細(xì)胞中的病毒含量較無感染性免疫復(fù)合物組高18.47～87.25倍，在感染36 h時(shí)PAM細(xì)胞中的病毒含量較無感染性免疫復(fù)合物組PRRSV增殖差異最大達(dá)到88.25倍，說明質(zhì)量濃度為0.68 g/L感染性免疫復(fù)合物在48 h內(nèi)能夠增強(qiáng)PRRSV的增殖，在36 h時(shí)作用最強(qiáng)（見圖 2）。

圖1 不同濃度疫苗血清對PRRSV增殖的影響

圖2 不同時(shí)間段PRRSV增殖情況

2.3 FcγRⅡb多抗阻斷PAM介導(dǎo)ADE作用結(jié)果FcγRⅡb多抗對三種疫苗免疫復(fù)合物誘發(fā)的ADE效應(yīng)都有一定的弱化作用，其中TJM-F92株免疫血清的ADE效應(yīng)最弱，可能是該毒株疫苗結(jié)構(gòu)片段與FcγRⅡb的結(jié)合能力有關(guān)。

圖3 三種疫苗血清對ADE效應(yīng)的弱化作用

3 討論與小結(jié)

1）據(jù)報(bào)道，PRRSV只在表達(dá)的FcγRⅡ細(xì)胞才發(fā)生ADE現(xiàn)象，本試驗(yàn)在選取試驗(yàn)材料時(shí)充分考慮了這一觀點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，免疫血清能通過FcγR介導(dǎo)增強(qiáng)靶細(xì)胞的吞噬作用，使得抗原-抗體復(fù)合物更易進(jìn)入胞內(nèi)[9]。IgG能激活巨噬細(xì)胞表面的Fc段IgG受體并與其結(jié)合，從而增加PRRSV進(jìn)入巨噬細(xì)胞的機(jī)會(huì)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的易感性。試驗(yàn)結(jié)果提示，三種疫苗血清均能影響FcγRⅡb多抗處理過的病毒增殖反應(yīng)，弱化ADE效應(yīng)，說明三種疫苗血清IgG均存在FC受體活性片段，這與上述研究結(jié)論是一致的。

2）TJM-F92疫苗株（NSP2基因缺失）免疫豬體后，能較好地刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-12，從而抑制野毒在患豬體內(nèi)的復(fù)制。PRRSV感染后的PAM細(xì)胞，炎性因子IL-12的生長會(huì)受到抑制。IL-12是促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化，實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)PRRSV復(fù)制的抑制效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)：PRRSV抑制宿主機(jī)體產(chǎn)生IL-12，用重組豬IL-12體外刺激感染PRRSV的豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMS）后，細(xì)胞中IFN-γ水平升高，豬肺泡巨噬細(xì)胞中PRRSV滴度降低[10]。

3）本試驗(yàn)中TJM-F92株疫苗血清對ADE效應(yīng)表現(xiàn)出較好的弱化效果，推測是該疫苗在刺激抗體產(chǎn)生的同時(shí)，一方面它對機(jī)體產(chǎn)生IL-12的活性作用較強(qiáng)；另一方面在該疫苗刺激下影響調(diào)控信號(hào)通路。有報(bào)道認(rèn)為，NSP2基因缺失會(huì)降低TLR2和TLR4的分泌，從而使豬體內(nèi)FcγRⅡ受體蛋白表達(dá)增強(qiáng)，因此表現(xiàn)了超強(qiáng)的ADE弱化效應(yīng)。是否還存在其他機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。