家族性血小板型出血病16型的遺傳診斷與咨詢

劉 靜,張慧娟,王 飛,李 靜,韓青云,張榮波

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,安徽 淮南 232001；2.河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,河南 鄭州 450003)

血小板無力癥(Glanzmann thrombocytasthenia，GT)是最常見的血小板遺傳性疾病，ITGA2B和ITGB3純合或復(fù)合雜合基因突變導(dǎo)致血小板膜表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa缺陷引起血小板聚集異常[1]。該疾病由GLANZMANN E首次報道，主要臨床特征為血小板聚集缺陷、血栓收縮異常[2-4]，為常染色體隱性遺傳。然而，ITGA2B和ITGB3基因的雜合子突變可能表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳的血小板型出血病16型 (platelet-type bleeding disorder-16，BDPLT16)[5]。BDPLT16臨床表現(xiàn)為先天性巨血小板減少癥，與血小板的大小不均有關(guān)，是一種血小板生成障礙，體外研究顯示有輕度血小板功能異常[6-8]。1960年，該病首先由CROSS描述了相近的臨床病癥[9-11]?；颊呖赡軟]有或僅有輕度增加的出血傾向，表現(xiàn)為出生后不久發(fā)病，為終生性的皮膚粘膜出血、淤血、鼻出血、貧血，女性則多見于經(jīng)期大量出血，血小板不能自發(fā)響應(yīng)多種誘導(dǎo)劑的聚集反應(yīng)，包括ADP、膠原、腎上腺素等。

本研究對一例臨床疑為血小板無力癥但表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳的家系患者進行基因突變分析，應(yīng)用目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測序技術(shù)，并通過Sanger測序驗證，明確病因和遺傳特征，為臨床醫(yī)生提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

先證者(III21)，男，31歲，自幼有出血傾向，多見于皮膚粘膜淤斑、牙齦出血、鼻出血、受傷后出血時間延長，長期嚴(yán)重貧血曾間斷輸血，臨床初步診斷懷疑為血小板無力癥。通過詢問疾病家族史，患者家族中還有其他類似出血癥狀患病成員，病情輕重不一，臨床信息和家系情況如表1和圖1所示。

表1 先證者家族臨床資料及基因檢測結(jié)果

表示先證者，表示男性，○表示女性；●、■表示患病圖1 家系圖和遺傳檢測結(jié)果

1.2 樣本采集與DNA提取

在征得患者及其親屬的同意下，采集先證者及其家族成員的外周血。通過基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)提取樣本DNA。本研究已經(jīng)獲得安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 目標(biāo)區(qū)域捕獲測序和Sanger測序驗證

打斷DNA并制備文庫，通過核酸探針對目標(biāo)基因編碼區(qū)和剪切區(qū)附近的DNA進行捕獲和富集，然后使用高通量測序平臺Illumina HiSeq 2500進行變異檢測。最后通過Sanger測序?qū)ο茸C者、父母及其他家系成員進一步驗證。

1.4 變異致病性分析

通過檢索dbSNP、1000genome、gnomMAD、ClinVar、OMIM等數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息以及國內(nèi)外的文獻。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷與家系分析

結(jié)合先證者表型和臨床檢查結(jié)果，醫(yī)生初始診斷為常染色體隱性遺傳的血小板無力癥。然而分析家族史信息，疾病傳遞明顯表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳(見圖1)，更可能為BDPLT16，待進一步明確診斷。

2.2 高通量測序與Sanger驗證

通過生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)解讀，先證者ITGA2B基因檢出c.2267+1G>T(NM-000419.3)的雜合變異。Sanger測序結(jié)果表明，患者父親攜帶ITGA2B基因c.2267+1G>T的雜合變異，而母親的ITGA2B基因未檢出(見圖2)，家族其他成員的檢測結(jié)果也表明，變異與疾病緊密連鎖。

圖2 先證者及父母 ITGA2B基因c.2267+1位點Sanger測序結(jié)果

2.3 變異致病性分析

c.2267+1G>T為剪接donor位點第一位堿基由 G變?yōu)門。根據(jù)內(nèi)含子剪切的GT-AG法則，該位點極度保守，變異極有可能導(dǎo)致內(nèi)含子不能剪接或引起外顯子缺失，通常對蛋白功能影響很大。dbSNP、1000genomes、gnomMAD數(shù)據(jù)庫均無該位點的頻率信息。ITGA2B基因ClinVar數(shù)據(jù)庫中已報道的15個致病變異，其中3個為剪切突變(見圖3)。結(jié)合患者的臨床表型和變異與在家系中與疾病連鎖情況，C.2267+1G>T變異極可能為致病變異，患者疾病可明顯診斷為BDPLT16。

圖3 ITGA2B基因致病變異譜ITGA2B基因目前已報道15個導(dǎo)致血小板無力癥的致病變異。黑色箭頭標(biāo)注為本研究首次發(fā)現(xiàn)的致病位點。

3 討論

BDPLT16是一種罕見的遺傳性出血疾病，臨床多見于終身性牙齦和皮膚粘膜組織出血，生化檢查表現(xiàn)為少量的血小板減少癥、巨血小板、血小板聚集減少但凝塊收縮正常。與GT的遺傳方式不同，BDPLT16表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，呈現(xiàn)出家族聚集性。Ghevaert等報道了英國一個家庭有5人患有BDPLT16[12]。日本報道了一個遺傳4代的家系，其中10人有輕度出血傾向，如鼻出血、皮膚粘膜瘀斑，患者血小板的GPIIb / IIIa復(fù)合物的表達降低[11]。

血小板糖蛋白GPIIb與GPIIIa形成GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物，是纖維蛋白原受體，也是血小板聚集中重要一環(huán)，其功能異常將會阻礙血小板與纖維蛋白的結(jié)合進而干擾正常的止血機制。GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的正常合成需要各個亞基的穩(wěn)定構(gòu)象以及二者相互作用才能形成復(fù)合物，任何亞基的異常都將影響GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的功能異常。

人類ITGA2B基因位于17號染色體q21-23的區(qū)域，基因全長17.2 Kb，包含30個外顯子[13-14]，編碼血小板糖蛋白GBIIb，其是血小板膜粘附蛋白受體復(fù)合物GPIIb / IIIa的α亞基，β亞基GPIIIa由ITGB3基因編碼。GPIIb / IIIa復(fù)合物屬于整聯(lián)蛋白類細胞粘附分子受體，其具有與α和β亞基共同的異二聚體結(jié)構(gòu)。GPIIb / IIIa復(fù)合物通過纖維蛋白原的受體介導(dǎo)血小板聚集。異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白Gα13直接結(jié)合整合素β3細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并且通過配體結(jié)合整合素IIb/β3以及GTP加載Gα13促進Gα13-整合素的相互作用。干擾Gα13表達或Gα13的豆蔻?；瘻p弱了蛋白激酶c-Src的活化并刺激了小鳥苷三磷酸酶RhoA，從而抑制細胞擴散，加速細胞回縮[15]。

ClinVar數(shù)據(jù)庫已報道ITGA2B基因目前有三個致病性剪接變異(c.1544+1G>A、c.2094+2T>C、c.2602-3C>G)。本研究中，先證者家系中檢出ITGA2B基因一個雜合子變異c.2267+1G>T，正常人群該變異頻率極低，ClinVar和HGMD數(shù)據(jù)庫及檢索相關(guān)文獻均未有報道，應(yīng)為首次發(fā)現(xiàn)。該位點位于ITGA2B基因22號內(nèi)含子，為剪接位點，可能導(dǎo)致缺乏GPIIb分子表達，進而造成患者血小板上嚴(yán)重缺乏GPIIb/IIIa而出現(xiàn)相關(guān)臨床癥狀。

BDPLT16表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，患者父母至少有一人攜帶致病基因，雜合ITGA2B基因突變即可引起B(yǎng)DPLT16。患者通常臨床表型差異較大，與遺傳背景和環(huán)境密切相關(guān)。BDPLT16目前尚無有效的治愈方法，出血是主要的臨床癥狀，病情嚴(yán)重可通過輸入血制品進行治療[16]。除輸血外，患者應(yīng)避免使用影響血小板功能的藥物，如阿司匹林(非甾體類抗炎藥)[17]。BDPLT16或GT患者在兒童早期和青春期使用鐵補充劑，以避免出血引起的缺鐵性貧血[18]。該類患者一般無法從臨床上直接診斷，需要借助基因檢測可明確病因。及早的確診和遺傳咨詢，有助于臨床治療和預(yù)防，進而減輕社會和家庭的經(jīng)濟負擔(dān)。