局部晚期直腸癌新輔助化放療病理學(xué)緩解的預(yù)測(cè)基因分析

代佳佳，肖 何，張 琴，李松霖，陳 川，王 閣

0 引 言

對(duì)于局部晚期直腸癌（locally advanced rectal cancer，LARC）患者，術(shù)前新輔助化放療（neoadjuvant radiochemotherapy，NCRT）后進(jìn)行全直腸系膜切除術(shù)（total mesorectal excision，TME）是目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方式［1-3］。相對(duì)于術(shù)后輔助放化療，NCRT可降低術(shù)前分期、提高手術(shù)切除率和保肛率，并顯著降低局部復(fù)發(fā)率［4-5］。然而在臨床實(shí)踐中，僅10%～30%的患者顯示病理完全緩解［6-8］。因此除術(shù)后TNM分期以外，術(shù)后病理結(jié)果顯示的腫瘤退縮分級(jí)（tumor regression grading，TRG）也NCRT效果評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)。

美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensice Cancer Netword，NCCN）指南推薦評(píng)估腫瘤治療反應(yīng)的病理學(xué)分級(jí)系統(tǒng)包括完全反應(yīng)（TRG4）：無(wú)活的癌細(xì)胞殘留；中度反應(yīng)（TRG3）：?jiǎn)蝹€(gè)或小簇癌細(xì)胞殘留；輕度反應(yīng)（TRG2）：殘留癌灶；反應(yīng)不良（TRG1）：僅少數(shù)或未見(jiàn)癌細(xì)胞消退［7］。研究表明，術(shù)前NCRT后腫瘤完全退縮（TRG4）和部分退縮（TRG3）與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存密切相關(guān)，腫瘤達(dá)到完全退縮的患者較退縮情況較差患者具有明顯的生存獲益［9-10］。目前，第7版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Commettee on Cancer，AJCC）分期已提出對(duì)直腸癌標(biāo)本檢查時(shí)應(yīng)評(píng)價(jià)新輔助治療后的治療反應(yīng)［11］。因此，對(duì)于術(shù)前放化療后能到達(dá)TRG 3/4級(jí)人群的預(yù)測(cè)有助于篩選出對(duì)NCRT最大獲益人群和避免對(duì)放化療不敏感患者的毒副反應(yīng)，對(duì)促進(jìn)直腸癌的個(gè)體化治療有重要的臨床意義。

迄今已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了各種臨床和分子生物學(xué)指標(biāo)對(duì)NCRT完全病理學(xué)緩解的影響因素及預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建［12-18］。其中包括治療前腫瘤大小和腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等臨床特征［12］、核磁共振影像組學(xué)特征［13］、腫瘤芽殖等病理形態(tài)特征［14］以及放化療敏感性相關(guān)基因標(biāo)簽等［15-18］；而基于基因標(biāo)簽的預(yù)測(cè)模型除具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值外，還因與腫瘤放療抵抗機(jī)制密切相關(guān)而具有放射生物學(xué)探索的價(jià)值。從樣本量考慮，合并多個(gè)數(shù)據(jù)集擴(kuò)大訓(xùn)練集樣本量對(duì)于構(gòu)建穩(wěn)定的預(yù)測(cè)模型具有重要作用［19］。因此，本研究試圖綜合分析4個(gè)局部晚期直腸癌NCRT基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集和腫瘤退縮等級(jí)，構(gòu)建預(yù)測(cè)模型以進(jìn)一步判斷該類(lèi)模型的臨床應(yīng)用價(jià)值和潛在的直腸癌放化療抵抗機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的獲取和前處理以“preoperative chemoradiotherapy”和“rectal cancer”或“neoadjuvant chemoradi otherapy”和“rectal cancer”作為檢索詞搜索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇可獲取基因微陣列表達(dá)值和腫瘤退縮分級(jí)的數(shù)據(jù)集，排除RNAseq、非編碼RNA數(shù)據(jù)集和沒(méi)有標(biāo)示退縮等級(jí)的數(shù)據(jù)集。共有4個(gè)數(shù)據(jù)集符合入組標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)集名稱(chēng)和相關(guān)信息見(jiàn)表1。采用R軟件包“annotate”將各微陣列探針I(yè)D號(hào)注釋到基因符號(hào)。對(duì)于多個(gè)探針對(duì)應(yīng)1個(gè)基因，取4分位距最大探針代表該基因表達(dá)值。以基因符號(hào)合并 GSE35452、GSE46862、GSE68204 3個(gè)數(shù)據(jù)集共174個(gè)樣本，其中79例達(dá)到TRG 3/4，緩解率為44.1%。利用“virtualArray”包函數(shù)“virtualArrayCom-Bat”對(duì)合并數(shù)據(jù)集的批次效應(yīng)進(jìn)行校正［20］。δ統(tǒng)計(jì)量和主成分分析判斷批次效應(yīng)校正結(jié)果［21］。

1.2 基于LASSO的Logistic回歸和SVM法篩選候選基因和模型構(gòu)建R軟件包“sample”函數(shù)隨機(jī)將174例合并數(shù)據(jù)集按7∶3比例分成訓(xùn)練集（n=121）和驗(yàn)證集（n=53）。對(duì)訓(xùn)練集采用單因素Logistic回歸篩選與TRG 3/4顯著相關(guān)的基因，依據(jù)回歸系數(shù)顯著性P值對(duì)基因進(jìn)行排秩，P＜0.05作為納入最小絕對(duì)值收斂和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LOSSA）算法的候選基因。LASSO算法構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，取λ對(duì)應(yīng)內(nèi)部交叉驗(yàn)證錯(cuò)配率最小值對(duì)應(yīng)變量作為模型變量，并在驗(yàn)證集中判斷該模型對(duì)TRG 3/4的診斷準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度。在訓(xùn)練集中對(duì)每個(gè)基因利用t檢驗(yàn)分析TRG3/4與TRG0/1/2組間表達(dá)值差異，并根據(jù)顯著性P值對(duì)基因進(jìn)行排秩，取前50個(gè)基因利用支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，在驗(yàn)證集中判斷該模型對(duì)TRG 3/4的診斷準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度，SVM算法各參數(shù)使用缺失值。以上2種分析分別反復(fù)隨機(jī)取樣500次，以判斷模型預(yù)測(cè)作用的穩(wěn)定性；并對(duì)基因排秩取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差以確定排秩前100基因的可重復(fù)性。LASSO算法和SVM分別采用R軟件包“glmnet”和“penalizedSVM”完成。

LASSO算法納入模型最多的前30個(gè)基因與獨(dú)立驗(yàn)證集GSE53781有重疊的基因共21個(gè)，再次在174例合并數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證該21個(gè)基因?qū)Σ±韺W(xué)緩解預(yù)測(cè)效能。同時(shí)在GSE53781中采用這21個(gè)基因單因素Logistic回歸系數(shù)與表達(dá)值乘積和作為化放療敏感指數(shù)（sensitivity index，SI）以判斷該指數(shù)對(duì)病理學(xué)緩解的預(yù)測(cè)作用。

1.3 基于差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析和基因功能注釋在174例合并數(shù)據(jù)集中。利用“l(fā)imma”包分析TRG3/4與TRG0/1/2組間差異表達(dá)基因。將多重校正前P＜0.05基因納入轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析，判斷差異表達(dá)基因潛在調(diào)控機(jī)制［22］?！皉eactome”包用于候選基因的功能注釋。

2 結(jié) 果

2.1 在 GSE35452、GSE46862、GSE68204構(gòu)成的數(shù)據(jù)集中構(gòu)建和驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型合并3個(gè)數(shù)據(jù)集后共12 803個(gè)基因納入分析。批次效應(yīng)校正前后δ統(tǒng)計(jì)量分別為2.350（P=0.008）和0.0257（P=1.000），主成分分析亦表明批次效應(yīng)校正后3個(gè)數(shù)據(jù)集來(lái)源病例在前2個(gè)主成分中無(wú)聚集性分布，見(jiàn)圖1。單因素Logistic回歸表明在500次隨機(jī)抽樣生成的訓(xùn)練集中，回歸系數(shù)顯著性P值最小的前100個(gè)基因P值均較大，僅3個(gè)基因P＜0.01，且有較大的變異幅度，見(jiàn)圖2。同樣，基因排秩靠前的100個(gè)基因平均秩也較大，并存在較大的變異幅度。LOSSA模型在訓(xùn)練集中的診斷準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度分別為0.998（95%CI：0.991～1.000）、1.000（95%CI：1.000～1.000）、0.998（95%CI：0.981～1.000）。但在驗(yàn)證集中卻得到較弱的診斷效能，準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度分別為 0.523（95%CI：0.396～0.642）、0.578（95%CI：0.373～0.762）、0.464（95%CI：0.258～0.700）。同樣，SVM法在驗(yàn)證集中的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度分別為 0.504（95%CI：0.377～0.623）、0.596（95%CI：0.393～0.830）、0.405（95%CI：0.182～0.650）。見(jiàn)圖3。

表1 所用數(shù)據(jù)庫(kù)名稱(chēng)和微陣列芯片Table 1 Series of GEO accession and platforms used for the analysis

圖1 GSE35452、GSE46862、GSE68204數(shù)據(jù)集合并后批次效應(yīng)校正前后主成分分析Figure 1 Principal component analysis before and after batch effect correction after merging three data sets

圖2 單因素Logistic回歸系數(shù)顯著性最高的前100個(gè)基因平均P值及排秩Figure 2 Average P values and ranks of the first 100 genes with the highest significance of coefficients from univariate Logistic regression in the training set

2.2 GSE53781作為外部驗(yàn)證集驗(yàn)證候選基因在500次訓(xùn)練集中引入LASSO算法模型次數(shù)最多的前30個(gè)基因中，有21個(gè)與GSE53781重疊。取該21個(gè)基因作為獨(dú)立驗(yàn)證的候選基因。LASSO算法表明這21個(gè)基因在合并數(shù)據(jù)集中對(duì)病理學(xué)完全緩解和接近病理學(xué)完全緩解病例的診斷準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度分別為 0.816、0.842、0.785。其調(diào)諧參數(shù)λ與對(duì)應(yīng)的錯(cuò)配率見(jiàn)圖4。敏感指標(biāo)病理學(xué)緩解診斷的AUC為0.863（95%CI：0.811～0.912）。21個(gè)候選基因符號(hào)和功能注釋以及回歸系數(shù)見(jiàn)表2。GSE53781數(shù)據(jù)集中有26例，其中10例達(dá)到病理學(xué)緩解，該組人群中計(jì)算得到的敏感指標(biāo)1.674～54.985，中位值為7.133）。敏感指標(biāo)有較高診斷效能（AUC=0.925，95%CI：0.817～1.000），見(jiàn)圖4。但是，對(duì)GSE53781隨機(jī)取出21個(gè)基因重復(fù)分析1000次得到對(duì)病理學(xué)緩解診斷的AUC 95%CI：0.769～0.969，21基因?qū)?yīng)的AUC處于該CI內(nèi)。

圖3 不同方法對(duì)新輔助化放療緩解診斷的特異性和靈敏度散點(diǎn)圖Figure 3 Scatter plots showing the sensitivity and specificity of the predictive model for response to neoadjuvant chemoradiotherapy in validation sets in 500 times of random sampling

圖4 合并數(shù)據(jù)集中21基因LASSO算法λ與內(nèi)部交叉驗(yàn)證錯(cuò)配率關(guān)系圖Figure 4 Relationship between internal cross-validation mismatch rate and lambda in LASSO algorithm with 21 candidate genes in the 174 merged datasets

2.3 LARC化放療抵抗基因參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在174例合并數(shù)據(jù)集12803個(gè)基因中，差異表達(dá)基因共505個(gè)。RNEA分析表明，這些差異表達(dá)基因主要受 NF-κB、CTNNB1、IL6/STAT3、E2F1、GLI2 以及MYC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因，見(jiàn)圖5。

表2 21個(gè)候選基因在合并數(shù)據(jù)集中Logistic回歸系數(shù)和部分功能注釋Table 2 Logistic regression coefficients and functional annotations of 21 candidate genes in the 174 merged datasets

圖 5 GSE35452、GSE46862、GSE68204 3個(gè)合并數(shù)據(jù)集中RNEA揭示緩解組與未緩解組間505個(gè)差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Transcription regulatory network of the 505 differentially expressed genes in the response and non-response groups in the 174 merged datasets

3 討 論

目前已有大量基于高通量基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析的腫瘤放射內(nèi)在敏感性研究試圖建立個(gè)體化放療指標(biāo)［23］。對(duì)于局部晚期直腸癌，已有若干研究篩選出了可構(gòu)建有效的NCRT病理學(xué)緩解或完全緩解預(yù)測(cè)模型的候選基因［15-18］。但這些基于統(tǒng)計(jì)量排秩而選擇“重要”基因納入模型構(gòu)建的方法易受訓(xùn)練集樣本量的影響。足夠樣本量的訓(xùn)練集才能得到穩(wěn)定的標(biāo)簽基因和預(yù)測(cè)效能。合并多個(gè)數(shù)據(jù)集的綜合分析可能具有提高構(gòu)建預(yù)測(cè)模型穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)［19，24］。本研究合并了 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE35452、GSE46862、GSE68204 3個(gè)數(shù)據(jù)集，共納入了12 803個(gè)基因數(shù)據(jù)值，通過(guò)在緩解組和未緩解組間采用Logistic回歸和t檢驗(yàn)，得出了平均排秩最小的100個(gè)基因，但這100個(gè)基因在121例訓(xùn)練集中并不穩(wěn)定；而且在不同次取樣構(gòu)成的訓(xùn)練集中，同一基因的排秩存在較大偏差，結(jié)合在各次取樣中對(duì)53例內(nèi)部驗(yàn)證集較弱的預(yù)測(cè)效能。該結(jié)果提示預(yù)測(cè)模型具有一定的預(yù)測(cè)能力，但驗(yàn)證效能不足，尚需進(jìn)一步深入研究。有文獻(xiàn)報(bào)道其他二分類(lèi)臨床結(jié)局預(yù)測(cè)模型僅使用了 120 例樣本已足夠［19，24］；但本研究單次用174例作為訓(xùn)練集也不足以得到穩(wěn)定的標(biāo)簽基因，且在不同的研究中得到的標(biāo)簽基因種類(lèi)很少重疊［15-18］。提示了參與直腸癌NRCT抵抗或敏感基因種類(lèi)在人群間存在較大異質(zhì)性，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。研究表明，在結(jié)直腸癌分子分型基礎(chǔ)上進(jìn)行預(yù)后標(biāo)志物篩選，或者聯(lián)合腫瘤細(xì)胞內(nèi)在基因與腫瘤微環(huán)境組成細(xì)胞如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、各種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群基因表達(dá)構(gòu)建療效預(yù)測(cè)模型是克服腫瘤異質(zhì)性的有效手段［25-26］。

本研究篩選出的21個(gè)預(yù)測(cè)基因可能與直腸癌放療和化療敏感性有密切聯(lián)系，涉及糖代謝、絲氨酸/甘氨酸合成與代謝、促凝血機(jī)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期調(diào)控等。如ST8SIA5基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶家族29，參與合成多種神經(jīng)節(jié)糖苷。同屬一個(gè)家族的另一個(gè)酶ST8SIA1則具有維持三陰乳腺癌細(xì)胞干性特征，并通過(guò)FAK-AKT-mTOR促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用［27］。AMT基因編碼氨基甲基轉(zhuǎn)移酶是構(gòu)成甘氨酸解理系統(tǒng)蛋白之一。線(xiàn)粒體絲氨酸/甘氨酸代謝系統(tǒng)對(duì)快速增殖腫瘤細(xì)胞所需的嘌呤核苷合成具有重要作用。而甘氨酸解理系統(tǒng)可清除該過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量甘氨酸，否則會(huì)在胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生氨基酮和丙酮醛等細(xì)胞毒性物質(zhì)［28］。而甘氨酸自身也可通過(guò)其受體抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［29］?？焖僭鲋车哪[瘤細(xì)胞很容易造成乏氧和瘤體中心區(qū)域的壞死。推測(cè)AMT可能對(duì)于維持直腸癌在快速增殖情況下改善乏氧并誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移有重要作用。因此，本研究結(jié)果提示AMT基因表達(dá)越高的直腸癌患者達(dá)到病理學(xué)緩解的概率越低。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)凝血酶（F2）表達(dá)可能對(duì)放療抵抗有重要影響。凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白/血小板凝聚被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移灶形成的機(jī)制之一。凝聚的血小板通過(guò)TGF-β1減弱自然殺傷細(xì)胞的功能，使微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視［30］。大量研究提示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或干性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療藥物具有較強(qiáng)的抵抗作用［31-32］。而本研究中，對(duì)緩解與未緩解組間差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析也提示這些差異表達(dá)基因主要受IL-6/STAT3、NF-kB和MYC等與腫瘤轉(zhuǎn)移或干性表型等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。如IL-6不但可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29上皮間葉轉(zhuǎn)化和血管擬態(tài)的形成，且與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)還可增強(qiáng)A549和H157非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系CD133+干細(xì)胞對(duì)放療誘導(dǎo)雙鏈斷裂的修復(fù)能力和抵抗凋亡的能力［31-32］。臨床研究也表明，浸潤(rùn)能力和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是直腸癌病理學(xué)完全緩解的不良預(yù)測(cè)因素［12，14］。因此，結(jié)合既往報(bào)道可以推測(cè)直腸癌中參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干性轉(zhuǎn)化機(jī)制并促進(jìn)轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境就是參與放化療抵抗的重要機(jī)制。

本研究納入分析的4個(gè)GEO數(shù)據(jù)集采用了不同的病理學(xué)緩解分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、所用雜交芯片檢測(cè)平臺(tái)不盡相同，微整列芯片重疊基因存在有限性以及未分細(xì)胞亞群分析等因素均成為本研究的局限性。盡管本研究并未建立明確的預(yù)測(cè)模型，分析結(jié)果提示直腸癌參與放化療抵抗的機(jī)制可能與其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制相關(guān)，并且強(qiáng)調(diào)了參與放化療抵抗基因在人群間的異質(zhì)性和基于腫瘤及其微環(huán)境多種細(xì)胞亞群研究的重要性。