Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復(fù)合物4過(guò)表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用

劉士明，丁 濤，雷良玉，胡 琳，冒 靈，陳 超，郭萌萌，徐 林

0 引 言

近年來(lái)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，現(xiàn)居全球癌癥的第3位［1-4］。腫瘤轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者療效和預(yù)后差的主要原因［5-8］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指具有極性的上皮細(xì)胞在某些特定的生理或病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過(guò)程。在這一過(guò)程中，上皮細(xì)胞或組織特性丟失，而獲得間質(zhì)細(xì)胞或組織的特性。大量研究顯示，腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移及侵襲能力的重要機(jī)制之一［9-13］。

Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復(fù)合物4（NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4，NDUFA4）是由人類NDUFA4基因編碼的線粒體呼吸鏈蛋白質(zhì)，其基因定位于人7號(hào)染色體p21.3上，總長(zhǎng)度為8234個(gè)堿基對(duì)，分子量約為9400；具有NADH脫氫酶和氧化還原酶活性，能夠?qū)㈦娮訌腘ADH轉(zhuǎn)移至呼吸鏈，參與能量代謝［14-15］。研究顯示NDUFA4的異常表達(dá)與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究前期發(fā)現(xiàn)NDUFA4過(guò)表達(dá)可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲［16］。然而，NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的可能作用和機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探討NDUFA4過(guò)表達(dá)對(duì)EMT的作用。

1材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞株和主要試劑人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)（TCHu99），質(zhì)粒p-NDUFA4和質(zhì)粒p-Cont（空載對(duì)照質(zhì)粒）均由遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室保存。McCoy′s 5A細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號(hào)：16600082）、胎牛血清（16000-044）、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（25300054）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、結(jié)晶紫染液（G1062）購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；100×三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合液）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（P7630）；Lipofectamine3000（L3000008）試劑購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)康寧Corning Costar公司；MMP2、MMP9、CXCR4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、GAPDH 引物均由上海Sangon Biotech公司合成，總RNA提取試劑盒（DP430）、FastQuant cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒（KR106-01）購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；SYBR?Premix Ex Taq? Version2.0（RR902A）購(gòu)于Takara公司；全蛋白提取試劑盒（KGP2100）、ECL顯色液（KGP1127）、RIPA裂解液（KGP702）均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份公司；β-Actin（AF0003）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗NDUFA4（Ab129752）、兔抗 E-Cadherin（Ab15148）、N-Cadherin（Ab76011）、SNAIL（Ab180714） 、TWIST（Ab5081）一抗以及鼠抗 Vimentin（Ab8069）一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（A0216）、羊抗兔二抗（A0208）均購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116選用McCoy′s 5A細(xì)胞培養(yǎng)液，其細(xì)胞培養(yǎng)液含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）和三抗（青霉素和鏈霉素-兩性霉素混合液），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，48 h換1次液，待HCT116細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 重組質(zhì)粒p-NDUFA4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將收集的細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞均勻接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為p-NDUFA4組（p-NDUFA4重組質(zhì)粒）、對(duì)照組（p-Cont對(duì)照質(zhì)粒），培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。次日，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染后形態(tài)的變化。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NDUFA4的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NDUFA4的表達(dá)參照文獻(xiàn)［16］。細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：①倒掉培養(yǎng)液，吸水紙吸干培養(yǎng)液；②每瓶細(xì)胞加入3 mL 4℃預(yù)冷的PBS，洗滌細(xì)胞3次；③每瓶細(xì)胞加入400 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min；④用干凈的刮棒刮掉細(xì)胞，將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中；⑤4℃12 000 r/min離心5 min；⑥將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中，放于-20℃保存。BCA法定量細(xì)胞蛋白樣品的檢測(cè)參照文獻(xiàn)［16］

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的的遷移能力以每孔5×105個(gè)細(xì)胞分別接種于24孔板，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；次日，待細(xì)胞貼壁后，用無(wú)菌槍頭尖端均勻等力在每個(gè)孔中垂直畫水平線；PBS清洗劃線的細(xì)胞，并更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；48 h時(shí)在相差倒置顯微鏡觀察下觀察劃痕細(xì)胞的遷移情況并拍照取樣。

1.2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力采用4℃預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1mg/mL，冰上操作；選擇8.0 μm孔徑的Transwell小室置于24孔板中，將2組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別稀釋至5×105/mL，每個(gè)上室加入100～200 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)下室加入600～800 μL含15%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的培養(yǎng)液；繼續(xù)在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，用棉簽棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，PBS反復(fù)漂洗3次，將小室移至10%多聚甲醛室溫固定20 min；隨后，將小室移至預(yù)先加入2%結(jié)晶紫溶液中染色，室溫染色15～30 min，PBS清洗小室中多余的染料；徹底晾干小室后，于倒置顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野的細(xì)胞、拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)MMP2、MMP9、CXCR4等轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)的檢測(cè)參照文獻(xiàn)［16，18-19］，MMP2等引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1。

1.2.7 Western blot檢測(cè)EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)免疫印跡檢測(cè)Twist、Snail等蛋白的方法參照文獻(xiàn)［17］。

1.2.8 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)免疫熒光檢測(cè)E-cadherin、Vimentin蛋白的方法參照文獻(xiàn)［20］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0軟件和image J軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均值比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NDUFA4在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況p-NDUFA4組NDUFA4-mRNA、NDUFA4蛋白相對(duì)表達(dá)量［（1.94±0.08）%、（1.07±0.12）%］較對(duì)照組［（0.96±0.15）%、（0.60±0.05）%］明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖1。

表1 轉(zhuǎn)移相關(guān)因子引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and amplification product lengths used for real-time quantitative PCR

圖1 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中NDUFA4的表達(dá)Figure 1 Expression of NDUFA4 in the human CRC HCT116 cells

2.2 NDUFA4過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h時(shí)，p-NDUFA4組細(xì)胞的體外遷移能力、細(xì)胞遷移率［（54.36±4.08）%、（1.85±0.10）%］較 對(duì) 照 組［（29.51±3.17）% 、（0.99±0.12）%］明顯升高（P＜0.01）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著時(shí)間的推移，2組細(xì)胞的劃痕間距逐漸變窄，48h時(shí)，p-NDUFA4組細(xì)胞劃痕間距明顯高于對(duì)照組。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，p-NDUFA4組穿過(guò)人工基底膠細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增多。見圖2。表明轉(zhuǎn)染p-NDUFA4重組質(zhì)粒能夠顯著促進(jìn)HCT116細(xì)胞的遷移。

圖2 NDUFA4過(guò)表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的體外遷移的影響Figure 2 Effect of NDUFA4 overexpression on the migration of the huam CRC HCT116 cells

2.3 NDUFA4過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響p-NDUFA4組腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP2、MMP9、CXCR4的mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)，上皮標(biāo)記分子E-cadherin mRNA明顯下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin，及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Snail、Twist的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。見表2。

2.4 Western blot檢測(cè)HCT116細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平p-NDUFA4組E-cadherin蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。見圖3，表2。

2.5 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，p-NDUFA4組細(xì)胞中E-cadherin的熒光較弱、表達(dá)量明顯下調(diào),Vimentin的熒光閃亮，呈明顯的紅色，表達(dá)量明顯增加。見圖4、圖5。

表2 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中各因子及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)（xˉ±s，%）Table 2 The mRNA expression levels of in the human CRC HCT116 cells（xˉ±s，%）

圖3 Western blot檢測(cè)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression levels of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，Twist and Snail proteins in the HCT116 cells

圖4 免疫熒光法檢測(cè)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)（×400）Figure 4 Expressions of E-cadherin and Vimentin in the human CRC HCT116 cells（IFA ×400）

圖5 免疫熒光法檢測(cè)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)（×400）Figure 5 Expressions of E-cadherin and Vimentin in the human CRC HCT116 cells（IFA ×400）

3 討 論

結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程與其轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。因此，探討結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生機(jī)制，不僅對(duì)進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)行為，且對(duì)于CRC靶向治療新策略開發(fā)均有著重要的理論價(jià)值和臨床意義。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，線粒體復(fù)合物關(guān)鍵酶NADH脫氫酶（輔酶）1α亞基（NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex，NDUFA）家族在機(jī)體組織器官發(fā)育和臨床腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［21-23］。近年來(lái)，隨著對(duì)NDUFA4研究的不斷深入，NDUFA家族分子在多種惡性腫瘤發(fā)揮的作用正逐漸被揭示。例如，NDUFA13在人肺癌組織中表達(dá)量明顯下降，與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為存在密切聯(lián)系［24-26］。有研究發(fā)現(xiàn)，癌基因Ras能夠直接下調(diào)肝組織線粒體復(fù)合物關(guān)鍵酶NADH脫氫酶（輔酶）1α亞基12（NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 12，Ndufa12）的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。這些研究提示NDUFA家族分子參與腫瘤發(fā)生過(guò)程的復(fù)雜性［27］。因此，深入探討不同NDUFA家族分子在特定腫瘤發(fā)生中的作用，不僅有利于NDUFA家族分子生物學(xué)功能的解析，而且對(duì)于相關(guān)腫瘤發(fā)生機(jī)制認(rèn)識(shí)和臨床生物防治新策略開發(fā)均具有重要意義。

近來(lái)研究顯示，作為NDUFA家族成員之一，NDUFA4也參與了腫瘤的發(fā)生過(guò)程［28］。本研究前期發(fā)現(xiàn)，微小RNA-7分子在體外可顯著抑制肺癌中NDUFA4的表達(dá)，且過(guò)表達(dá)NDUFA4可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究觀察到，在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NDUFA4，可顯著促進(jìn)HCT116細(xì)胞的遷移能力，同時(shí)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP2、MMP9和CXCR4的表達(dá)均明顯上調(diào)，提示NDUFA可顯著促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力。為了進(jìn)一步分析NDUFA對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生的影響，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞中EMT轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志物E-cadherin明顯下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin，及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Snail、Twist表達(dá)顯著上調(diào)。周宇箭等［29］報(bào)道，核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor，RI）基因過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，可能與其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子snail、Twistl等的表達(dá)密切相關(guān)。和本研究結(jié)果一致。均提示NDUFA4可能是人結(jié)直腸癌EMT發(fā)生中的新調(diào)控分子，其通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist的表達(dá)調(diào)控，使EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)發(fā)生改變，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。然而，其相關(guān)確切機(jī)制仍有待后續(xù)研究闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NDUFA4可促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT的發(fā)生。為后續(xù)人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制的研究，以及相關(guān)臨床治療策略開發(fā)提供了重要的前期基礎(chǔ)。