劉士明,丁 濤,雷良玉,胡 琳,冒 靈,陳 超,郭萌萌,徐 林
近年來,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升,現(xiàn)居全球癌癥的第3位[1-4]。腫瘤轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者療效和預(yù)后差的主要原因[5-8]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有極性的上皮細(xì)胞在某些特定的生理或病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程。在這一過程中,上皮細(xì)胞或組織特性丟失,而獲得間質(zhì)細(xì)胞或組織的特性。大量研究顯示,腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移及侵襲能力的重要機(jī)制之一[9-13]。
Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復(fù)合物4(NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4,NDUFA4)是由人類NDUFA4基因編碼的線粒體呼吸鏈蛋白質(zhì),其基因定位于人7號染色體p21.3上,總長度為8234個堿基對,分子量約為9400;具有NADH脫氫酶和氧化還原酶活性,能夠?qū)㈦娮訌腘ADH轉(zhuǎn)移至呼吸鏈,參與能量代謝[14-15]。研究顯示NDUFA4的異常表達(dá)與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究前期發(fā)現(xiàn)NDUFA4過表達(dá)可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[16]。然而,NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的可能作用和機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探討NDUFA4過表達(dá)對EMT的作用。
1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞株和主要試劑人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購自中國生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫(TCHu99),質(zhì)粒p-NDUFA4和質(zhì)粒p-Cont(空載對照質(zhì)粒)均由遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室保存。McCoy′s 5A細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號:16600082)、胎牛血清(16000-044)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(25300054)均購自美國Gibco公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、結(jié)晶紫染液(G1062)購于北京索萊寶生物科技有限公司;100×三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合液)購自北京索萊寶科技有限公司(P7630);Lipofectamine3000(L3000008)試劑購于賽默飛世爾科技公司;Transwell小室、Matrigel膠購自美國康寧Corning Costar公司;MMP2、MMP9、CXCR4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、GAPDH 引物均由上海Sangon Biotech公司合成,總RNA提取試劑盒(DP430)、FastQuant cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒(KR106-01)購自北京天根生物科技有限公司;SYBR?Premix Ex Taq? Version2.0(RR902A)購于Takara公司;全蛋白提取試劑盒(KGP2100)、ECL顯色液(KGP1127)、RIPA裂解液(KGP702)均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份公司;β-Actin(AF0003)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗NDUFA4(Ab129752)、兔抗 E-Cadherin(Ab15148)、N-Cadherin(Ab76011)、SNAIL(Ab180714) 、TWIST(Ab5081)一抗以及鼠抗 Vimentin(Ab8069)一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(A0216)、羊抗兔二抗(A0208)均購自Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116選用McCoy′s 5A細(xì)胞培養(yǎng)液,其細(xì)胞培養(yǎng)液含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)和三抗(青霉素和鏈霉素-兩性霉素混合液),培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2,48 h換1次液,待HCT116細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%時,胰蛋白酶消化細(xì)胞,離心后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 重組質(zhì)粒p-NDUFA4瞬時轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將收集的細(xì)胞以每孔1×105個細(xì)胞均勻接種于6孔板,實(shí)驗(yàn)分為p-NDUFA4組(p-NDUFA4重組質(zhì)粒)、對照組(p-Cont對照質(zhì)粒),培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時,按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。次日,使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染后形態(tài)的變化。
1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NDUFA4的表達(dá)實(shí)時熒光定量PCR檢測NDUFA4的表達(dá)參照文獻(xiàn)[16]。細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備:①倒掉培養(yǎng)液,吸水紙吸干培養(yǎng)液;②每瓶細(xì)胞加入3 mL 4℃預(yù)冷的PBS,洗滌細(xì)胞3次;③每瓶細(xì)胞加入400 μL含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min;④用干凈的刮棒刮掉細(xì)胞,將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中;⑤4℃12 000 r/min離心5 min;⑥將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中,放于-20℃保存。BCA法定量細(xì)胞蛋白樣品的檢測參照文獻(xiàn)[16]
1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的的遷移能力以每孔5×105個細(xì)胞分別接種于24孔板,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng);次日,待細(xì)胞貼壁后,用無菌槍頭尖端均勻等力在每個孔中垂直畫水平線;PBS清洗劃線的細(xì)胞,并更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);48 h時在相差倒置顯微鏡觀察下觀察劃痕細(xì)胞的遷移情況并拍照取樣。
1.2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力采用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1mg/mL,冰上操作;選擇8.0 μm孔徑的Transwell小室置于24孔板中,將2組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞分別稀釋至5×105/mL,每個上室加入100~200 μL細(xì)胞懸液,每個下室加入600~800 μL含15%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的培養(yǎng)液;繼續(xù)在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h,棄培養(yǎng)液,用棉簽棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞,PBS反復(fù)漂洗3次,將小室移至10%多聚甲醛室溫固定20 min;隨后,將小室移至預(yù)先加入2%結(jié)晶紫溶液中染色,室溫染色15~30 min,PBS清洗小室中多余的染料;徹底晾干小室后,于倒置顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)3個視野的細(xì)胞、拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均數(shù)。
1.2.6 實(shí)時熒光定量 PCR法檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)MMP2、MMP9、CXCR4等轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)的檢測參照文獻(xiàn)[16,18-19],MMP2等引物序列及擴(kuò)增長度見表1。
1.2.7 Western blot檢測EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)免疫印跡檢測Twist、Snail等蛋白的方法參照文獻(xiàn)[17]。
1.2.8 免疫熒光法檢測各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)免疫熒光檢測E-cadherin、Vimentin蛋白的方法參照文獻(xiàn)[20]。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0軟件和image J軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間均值比較采用單因素方差分析,兩兩間比較采用LSD法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 NDUFA4在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況p-NDUFA4組NDUFA4-mRNA、NDUFA4蛋白相對表達(dá)量[(1.94±0.08)%、(1.07±0.12)%]較對照組[(0.96±0.15)%、(0.60±0.05)%]明顯上調(diào)(P<0.05),見圖1。
表1 轉(zhuǎn)移相關(guān)因子引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequences and amplification product lengths used for real-time quantitative PCR
圖1 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中NDUFA4的表達(dá)Figure 1 Expression of NDUFA4 in the human CRC HCT116 cells
2.2 NDUFA4過表達(dá)對HCT116細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h時,p-NDUFA4組細(xì)胞的體外遷移能力、細(xì)胞遷移率[(54.36±4.08)%、(1.85±0.10)%]較 對 照 組[(29.51±3.17)% 、(0.99±0.12)%]明顯升高(P<0.01)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著時間的推移,2組細(xì)胞的劃痕間距逐漸變窄,48h時,p-NDUFA4組細(xì)胞劃痕間距明顯高于對照組。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,p-NDUFA4組穿過人工基底膠細(xì)胞數(shù)較對照組增多。見圖2。表明轉(zhuǎn)染p-NDUFA4重組質(zhì)粒能夠顯著促進(jìn)HCT116細(xì)胞的遷移。
圖2 NDUFA4過表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的體外遷移的影響Figure 2 Effect of NDUFA4 overexpression on the migration of the huam CRC HCT116 cells
2.3 NDUFA4過表達(dá)對HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響p-NDUFA4組腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP2、MMP9、CXCR4的mRNA表達(dá)較對照組顯著上調(diào),上皮標(biāo)記分子E-cadherin mRNA明顯下調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin,及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Snail、Twist的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。見表2。
2.4 Western blot檢測HCT116細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平p-NDUFA4組E-cadherin蛋白的表達(dá)較對照組顯著下調(diào)、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖3,表2。
2.5 免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:與對照組相比,p-NDUFA4組細(xì)胞中E-cadherin的熒光較弱、表達(dá)量明顯下調(diào),Vimentin的熒光閃亮,呈明顯的紅色,表達(dá)量明顯增加。見圖4、圖5。
表2 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中各因子及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)(xˉ±s,%)Table 2 The mRNA expression levels of in the human CRC HCT116 cells(xˉ±s,%)
圖3 Western blot檢測人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression levels of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Twist and Snail proteins in the HCT116 cells
圖4 免疫熒光法檢測人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)(×400)Figure 4 Expressions of E-cadherin and Vimentin in the human CRC HCT116 cells(IFA ×400)
圖5 免疫熒光法檢測人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)(×400)Figure 5 Expressions of E-cadherin and Vimentin in the human CRC HCT116 cells(IFA ×400)
結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過程與其轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。因此,探討結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生機(jī)制,不僅對進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)行為,且對于CRC靶向治療新策略開發(fā)均有著重要的理論價值和臨床意義。相關(guān)文獻(xiàn)報道,線粒體復(fù)合物關(guān)鍵酶NADH脫氫酶(輔酶)1α亞基(NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex,NDUFA)家族在機(jī)體組織器官發(fā)育和臨床腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[21-23]。近年來,隨著對NDUFA4研究的不斷深入,NDUFA家族分子在多種惡性腫瘤發(fā)揮的作用正逐漸被揭示。例如,NDUFA13在人肺癌組織中表達(dá)量明顯下降,與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為存在密切聯(lián)系[24-26]。有研究發(fā)現(xiàn),癌基因Ras能夠直接下調(diào)肝組織線粒體復(fù)合物關(guān)鍵酶NADH脫氫酶(輔酶)1α亞基12(NADH dehydrogenase(ubiquinone)1 alpha subcomplex 12,Ndufa12)的表達(dá),導(dǎo)致線粒體功能障礙并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。這些研究提示NDUFA家族分子參與腫瘤發(fā)生過程的復(fù)雜性[27]。因此,深入探討不同NDUFA家族分子在特定腫瘤發(fā)生中的作用,不僅有利于NDUFA家族分子生物學(xué)功能的解析,而且對于相關(guān)腫瘤發(fā)生機(jī)制認(rèn)識和臨床生物防治新策略開發(fā)均具有重要意義。
近來研究顯示,作為NDUFA家族成員之一,NDUFA4也參與了腫瘤的發(fā)生過程[28]。本研究前期發(fā)現(xiàn),微小RNA-7分子在體外可顯著抑制肺癌中NDUFA4的表達(dá),且過表達(dá)NDUFA4可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究觀察到,在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)NDUFA4,可顯著促進(jìn)HCT116細(xì)胞的遷移能力,同時腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP2、MMP9和CXCR4的表達(dá)均明顯上調(diào),提示NDUFA可顯著促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力。為了進(jìn)一步分析NDUFA對人結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生的影響,本研究進(jìn)一步檢測了細(xì)胞中EMT轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志物E-cadherin明顯下調(diào),間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin,及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Snail、Twist表達(dá)顯著上調(diào)。周宇箭等[29]報道,核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因過表達(dá)可顯著促進(jìn)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞EMT的發(fā)生,從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,可能與其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子snail、Twistl等的表達(dá)密切相關(guān)。和本研究結(jié)果一致。均提示NDUFA4可能是人結(jié)直腸癌EMT發(fā)生中的新調(diào)控分子,其通過對轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist的表達(dá)調(diào)控,使EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)發(fā)生改變,從而促進(jìn)EMT的發(fā)生,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。然而,其相關(guān)確切機(jī)制仍有待后續(xù)研究闡明。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)NDUFA4可促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT的發(fā)生。為后續(xù)人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制的研究,以及相關(guān)臨床治療策略開發(fā)提供了重要的前期基礎(chǔ)。