中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)外側(cè)區(qū)神經(jīng)元P2X7受體激活對(duì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響

李鵬濤，李尤艷，肖 智

0 引 言

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）可以作為一種信號(hào)物質(zhì)，參與神經(jīng)信息傳遞。ATP與其特異性受體或受體亞型結(jié)合后誘發(fā)細(xì)胞外鈣離子和Na+胞內(nèi)，細(xì)胞膜去極化形成動(dòng)作電位。研究發(fā)現(xiàn)，ATP受體分為P2X和P2Y兩類，P2X受體目前分為P2X1～7共7個(gè)亞型［1］，其中 P2X7受體由于特殊的分子結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，在炎癥、慢性疼痛、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。研究證實(shí)機(jī)體存在一個(gè)由多個(gè)腦區(qū)組成的調(diào)制痛覺的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)即內(nèi)源性的疼痛調(diào)制系統(tǒng)，其中中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（midbrain periaqueductal gray，PAG）是該疼痛調(diào)制系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠PAG中有P2X7受體表達(dá)且P2X7受體激活介入大鼠炎癥性疼痛以及嗎啡耐受的形成及維持機(jī)制［2-3］。

激光共聚焦（laser scanning confocal microscopy，LSCM）技術(shù)是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究中較前沿的技術(shù)，可以在亞細(xì)胞水平上對(duì)鈣離子實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化等信息進(jìn)行采集［4-5］?；赑2X7受體激活后是否引起PAG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的變化未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬通過原代培養(yǎng)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)外側(cè)區(qū)（lateral periaqueductal gray，lPAG）神經(jīng)元細(xì)胞，采用激光共聚焦技術(shù)觀察P2X7受體激動(dòng)劑苯甲酰苯甲酸ATP（BzATP）對(duì)lPAG神經(jīng)元細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子變化的影響，從而證實(shí)lPAG中神經(jīng)元P2X7受體激活引起胞內(nèi)鈣離子變化進(jìn)而參與對(duì)lPAG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物采用SPF級(jí)SD孕鼠所產(chǎn)＜3 d乳大鼠，雌雄不拘，購(gòu)于重慶陸軍軍醫(yī)大學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（渝）2012-0005。乳大鼠置于濕度45%～50%，溫度（22±4）℃左右環(huán)境中，自由飲食，自然采光。本實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守遵義醫(yī)科大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理綱要進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中盡量減少乳大鼠使用量以及乳大鼠所承受的痛苦。

1.2 主要儀器與試劑P2X7受體拮抗劑A-740003（美國(guó)Sigma公司），B27培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基和層黏蛋白（laminin）（英國(guó)Gebco公司）；BzATP、阿糖胞苷購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，小鼠抗大鼠神經(jīng)元特異性核蛋白（Neuron specific nuclear protein，NeuN）抗體購(gòu)于abcam公司，山羊抗小鼠IgG-HRP（北京中山金橋生物技術(shù)公司）；Fluo-4/AM熒光染料、F-127（日本Dojindo公司）；激光共聚焦成像系統(tǒng)（德國(guó)LEICA公司TCS SP2型）。

1.3 方法

1.3.1 lPAG神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)將乳大鼠吸入乙醚麻醉。全身浸泡消毒后無菌條件下斷頭，小心取出完整的腦組織。腦組織置于解剖顯微鏡下剔除腦膜和附著的結(jié)締組織。尋找并確認(rèn)中腦后，用9號(hào)注射器針頭仔細(xì)分離lPAG組織。將剝離出的lPAG組織在37℃下用0.125%胰蛋白酶消化30 min；將組織混合液以離心半徑80 cm、以1000 r/min離心3～5 min、棄上清，加入DMEM/F12混合液，緩慢吹打使細(xì)胞混勻，將混勻的細(xì)胞懸液接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，放入5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)3 h后將DMEM/F12混合液換成神經(jīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液（Neurobasal+B27+谷氨酰胺）；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞貼壁12 h左右，用阿糖胞苷（10 μmol/L）抑制原代細(xì)胞內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

1.3.2 lPAG神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞4 d后，將細(xì)胞爬片取出，4%多聚甲醛溶液固定30 min后加入小牛血清封閉30 min，順序滴加小鼠抗大鼠anti-NeuN一抗抗體（1∶400）及二抗（山羊抗小鼠IgG-HRP 1∶200），DAB顯色1～5 min，明膠貼片、梯度乙醇脫水，生物透明劑透明，中性樹膠封片，倒置顯微鏡鏡下觀察并采集圖像。

1.3.3 激光共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子變化①Fluo-4/AM負(fù)載入細(xì)胞：取出培養(yǎng)4 d的lPAG神經(jīng)元細(xì)胞，激光共聚焦培養(yǎng)皿皿底及周圍用DMEM/12培養(yǎng)液潤(rùn)洗3～4次，滴加Fluo-4/AM（5 μmol/L）與0.02%Pluronic F127的混合溶液。細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng)，避光，孵育30 min；取出后加入少量DMEM/F12培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞；用激光共聚焦顯微鏡對(duì)鈣離子進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)；胞內(nèi)鈣離子變化水平檢測(cè)：分別加入實(shí)驗(yàn)藥物，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化。用鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化直接反映神經(jīng)元細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子變化水平。激光共聚焦掃描的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm，掃描的頻率為2 s/幀，時(shí)間5 min。先檢測(cè)靜息狀態(tài)下的鈣離子的熒光強(qiáng)度，待熒光強(qiáng)度穩(wěn)定后，加入藥物，檢測(cè)鈣離子的熒光強(qiáng)度變化情況。鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度等于加入藥物后鈣離子熒光強(qiáng)度比上靜息狀態(tài)下的鈣離子熒光強(qiáng)度。②不同藥物對(duì)Fluo-4/AM負(fù)載的培養(yǎng)lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的影響。激光共聚焦鈣成像技術(shù)顯示：低濃度的BzATP（0.1 μmol/L和1 μmol/L）對(duì)lPAG培養(yǎng)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子無影響，高濃度的BzATP（10 μmol/L及100 μmol/L）可使培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子升高，神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平隨BzATP的濃度升高而升高，且升高的維持時(shí)間更長(zhǎng)，故選用100 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。原代培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)元隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（不加入藥物），僅供對(duì)照；BzATP組（100 μmol/L）；A-740003+BzATP組：先加入100 nmol/L A-740003孵育10 min，再加入10 μmol/L 的BzATP；BzATP對(duì)照組：先加入無鈣液孵育20 min，再加入BzATP。其中空白對(duì)照組、BzATP組、A-740003+BzATP組孵育液均為DMEM/F12培養(yǎng)基，BzATP對(duì)照組孵育液為無鈣液。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。各組間采用單因素方差（one-way，ANOVA）分析進(jìn)行處理，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)元形態(tài)觀察及鑒定原代培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)元體積較小，多數(shù)為圓形或橢圓形，單個(gè)分布未見突起；接種3 h后，接種細(xì)胞陸續(xù)貼壁，周圍可見微弱的光暈；貼壁后1 d有少量突起長(zhǎng)出，細(xì)胞間連接較少；神經(jīng)元細(xì)胞貼壁3～4 d后，絕大部分細(xì)胞突起變得明顯，突起較短，細(xì)胞核明顯，光暈增強(qiáng)，見圖1。本實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)4d的lPAG神經(jīng)元細(xì)胞，采用熒光鈣指示劑Fluo-4/AM負(fù)載后在熒光顯微鏡下可以看到負(fù)載后的細(xì)胞胞體發(fā)出綠色熒光，見圖2。

2.2 P2X7受體活化對(duì)神經(jīng)元 胞內(nèi)鈣離子的影響激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示：BzATP組神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度（2.48±1.05）較空白對(duì)照組、BzATP對(duì)照組、A-740003+BzATP組［（1.12±0.03）、（1.09±0.03）、（1.14±0.08）］明顯升高（P＜0.01）。

圖1 lPAG神經(jīng)元原代培養(yǎng)（×200）Figure 1 lPAG neurons cultivated（×200）

圖2 熒光負(fù)載后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及熒光強(qiáng)度（×400）Figure 2 The morphological structure and fluorescence intensity of cells under fluorescence loading（×400）

3 討 論

P2X7受體由于其自身結(jié)構(gòu)特殊性，與其他的嘌呤受體亞型比較，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①P2X7受體對(duì)局部微環(huán)境中ATP的親和力相對(duì)較低，當(dāng)局部微環(huán)境中對(duì)ATP濃度在100～1000 μmol/L時(shí)，ATP才能激活P2X7受體，進(jìn)而引發(fā)下游反應(yīng)；②持續(xù)的ATP或高濃度的ATP刺激下，P2X7受體激活形成的通道可以轉(zhuǎn)變?yōu)橹睆捷^大的孔道，此孔道可以對(duì)分子量較大的物質(zhì)進(jìn)行通透；③炎癥因子的持續(xù)作用可以提高P2X7受體對(duì)ATP的敏感性，以上特點(diǎn)使得P2X7受體在炎癥、慢性疼痛［6］、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤［7］和細(xì)胞毒性的病理機(jī)制中有重要作用。

P2X7受體激活后大量表達(dá)在中樞小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，參與感覺信號(hào)傳導(dǎo)包括疼痛的產(chǎn)生和維持［8-9］。值得一提的是對(duì)于P2X7受體的表達(dá)部位一直存在爭(zhēng)議，有人認(rèn)為P2X7受體僅表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，但近年來的一系列研究也證實(shí)P2X7受體表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元［10］。NeuN是研究中常用的成熟神經(jīng)元的標(biāo)記蛋白，在本研究中，通過對(duì)培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行NeuN免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，NeuN陽性表達(dá)部位與P2X7受體存在共表達(dá)，說明本研究中原代培養(yǎng)的細(xì)胞主要是神經(jīng)元細(xì)胞。

目前認(rèn)為重組大鼠P2X7受體激動(dòng)劑效價(jià)最好的是BzATP，BzATP是穩(wěn)定的ATP類似物，它的效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ATP。文獻(xiàn)報(bào)道該受體的激動(dòng)劑效價(jià)依次為 BzATP?ATP＞2MeSATP＞ATPγS?ADP［11-12］。BzATP激活人和大鼠P2X7受體的效能是ATP的50倍［13］。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或細(xì)胞損傷時(shí)，ATP激活P2X7受體，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子快速增加［14-15］。而A-740003能有效的拮抗BzATP激活大鼠和人P2X7受體所誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子變化；與PPADS、BBG或KN-62等其他的P2X7受體拮抗劑相比較，A-740003更能有效阻斷BzATP誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子變化，阻斷P2X7受體介導(dǎo)的膜孔形成［16］，因此在本研究中選用A-740003拮抗P2X7受體激活。

細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的微小變化能快速有效的調(diào)節(jié)細(xì)胞生理過程。胞內(nèi)鈣離子升高可以通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣庫(kù)釋放、細(xì)胞外鈣離子胞內(nèi)及鈣離子周期性變化誘發(fā)的鈣振蕩等所致。BzATP引起的神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子升高可能是受其中的一種或多種方式調(diào)節(jié)［17］。本研究中，培養(yǎng)神經(jīng)元經(jīng)10 μmol/L BzATP孵育后可導(dǎo)致lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平迅速升高，而給予P2X7受體特異性拮抗劑A-740003預(yù)孵育后再給予10 μmol/L BzATP孵育，lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平未見明顯變化，說明10 μmol/L BzATP升高胞內(nèi)鈣離子水平的效應(yīng)能被P2X7受體特異性拮抗劑A-740003阻斷，BzATP導(dǎo)致的lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子升高是通過P2X7受體活化介導(dǎo)的。此外，使用EGTA螯合細(xì)胞外鈣離子后的無鈣液孵育后，10 μmol/L BzATP不能使lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子升高，說明10 μmol/L BzATP所致的lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子升高主要是由細(xì)胞外鈣離子胞內(nèi)所引起，而非細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放［18］。

本研究中僅觀察不同濃度的Bz-ATP預(yù)孵育對(duì)離體培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平的影響，在后續(xù)的研究中將對(duì)在體或病理狀態(tài)下，PAG神經(jīng)元P2X7受體激活情況以及胞內(nèi)鈣離子水平變化進(jìn)行觀察研究。

綜上所述，P2X7受體激活后可以升高lPAG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平且與細(xì)胞外鈣離子胞內(nèi)有關(guān)。