藥物代謝酶CYP2E1、GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與抗結(jié)核藥物性肝損傷的相關(guān)性研究

鄧樂(lè)樂(lè)，韋麗琴，郝金奇，張 冬，胡寶翠

0 引 言

世界衛(wèi)生組織《2017年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，結(jié)核病是全球第九大致死性疾病，是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染性疾病。2016年全球約有1040萬(wàn)新增結(jié)核病病例，其中我國(guó)的新發(fā)病例數(shù)占7.48%［1］。近年來(lái)，盡管結(jié)核病在國(guó)家推薦的標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核藥物方案下得到了有效的治療和控制，但藥物不良反應(yīng)所導(dǎo)致機(jī)體損傷也逐漸受到了人們的重視。已有臨床研究證明，異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等一線抗結(jié)核藥物均可產(chǎn)生不同程度的肝毒性［2］。在服用一線藥物的結(jié)核病患者中，部分患者出現(xiàn)了抗結(jié)核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis drug induced liver injury，ATLI），發(fā)生率在2.55%～34.90%［3-5］。多項(xiàng)研究表明高齡、女性、慢性乙?；癄顟B(tài)、營(yíng)養(yǎng)不良、艾滋病毒攜帶等環(huán)境因素是ATLI發(fā)生的危險(xiǎn)因素［6-8］。除此之外，約20%～95%的ATLI發(fā)生是由較為重要的遺傳因素決定的［9］。

在遺傳因素方面，越來(lái)越多的研究表明藥物代謝酶在ATLI發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，主要包括細(xì)胞色素P450酶系（Cytochrome P450，CYP450）、氮 乙酰 基轉(zhuǎn) 移 酶（Nacetyltransferase，NATs）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GSTs）等［10-11］?；蚨鄳B(tài)性是藥物代謝酶的一個(gè)重要特征，是導(dǎo)致藥物個(gè)體差異的重要原因之一。多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)CYP2E1基因多態(tài)性與ATLI的發(fā)生有關(guān)［12-14］。有研究發(fā)現(xiàn)GSTM1缺失基因型是ATLI發(fā)生的影響因素［15］。但是藥物代謝酶表現(xiàn)出的多態(tài)性并不能完全解釋個(gè)體差異的存在。隨著基因組學(xué)研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向基因組的另一類信息：表觀遺傳學(xué)信息。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾重要的一部分，既往研究表明DNA異常甲基化與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)［16］，而藥物代謝酶基因異常甲基化是否與ATLI發(fā)生有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要探討藥物代謝酶CYP2E1和GSTM1基因甲基化水平與ATLI之間的關(guān)系，闡述ATLI發(fā)病機(jī)制，為ATLI的發(fā)生提供病因?qū)W線索。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2016年9月至2018年12月在內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市結(jié)核病防治所已確診并進(jìn)行治療的93例蒙古族肺結(jié)核患者資料。根據(jù)是否發(fā)生ATLI分為2組：肝損傷組（接受抗結(jié)核藥物治療6個(gè)月內(nèi)發(fā)生ATLI的蒙古族結(jié)核病患者，n=31）、對(duì)照組（與肝損傷組同性別、年齡相差≤5歲、接受抗結(jié)核藥物治療6個(gè)月內(nèi)未發(fā)生ATLI的蒙古族結(jié)核病患者，n=62）。肝損傷組男16例，女15例，平均年齡（41.55±13.37）歲；對(duì)照組男32例，女30例，平均年齡（41.03±14.61）歲。入組依據(jù)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2008）》［17］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等藥物治療；②抗結(jié)核治療前肝功能正常，治療期間至少有3次以上肝功能檢查結(jié)果；③3代均無(wú)與外族通婚史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他肝疾?。ň凭愿尾　⒆陨砻庖咝愿窝?、病毒性肝炎等），或其他可能導(dǎo)致肝功能紊亂的全身性疾病的患者；②已確診具有酒精性肝損傷患者，或未經(jīng)確診但有酗酒史者。本研究經(jīng)過(guò)學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號(hào)：2018（003）］，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 抗結(jié)核藥物性肝損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《抗結(jié)核藥物所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》。間隔 2周以上、連續(xù) 2次檢測(cè) ALT＞40 U/L，或/和TBIL＞38 μmol/L，或單次檢測(cè)ALT＞80 U/L即可定義為 ATLI［18］。

1.3 研究方法

1.3.1 收集基礎(chǔ)資料包括人口學(xué)特征、生活方式與習(xí)慣、結(jié)核病類型、既往患病史及服藥史、肝功檢查結(jié)果等疾病相關(guān)情況。調(diào)查問(wèn)卷是由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的結(jié)核病防治研究所工作人員采用面對(duì)面問(wèn)答方式完成，同時(shí)填寫(xiě)知情同意書(shū)。

1.3.2 DNA提取及亞硫酸鹽修飾采集血樣，采用DNA提取試劑盒（購(gòu)于天根生化科技有限公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞裂解，離心后提取細(xì)胞核沉淀，用蛋白酶溶液和RNA溶液處理，再進(jìn)行多次吸附柱處理，加入50 μL緩沖液溶解DNA。所提取DNA需滿足濃度＞30 ng/uL，純度 A260/A2801.7～2.0，A260/A230＞1.4，置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。使用亞硫酸鹽處理試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行修飾，其原理是將樣本DNA中沒(méi)有甲基化的C全部轉(zhuǎn)化為U。

1.3.3 甲基化檢測(cè)基于MassARRAY平臺(tái)檢測(cè)甲基化水平，過(guò)程主要包括：亞硫酸鹽修飾后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（CYP2E1和GSTM1引物序列分別為：5′端引物：GTTTTGAGAAGGAGGGTGATTTATT，3′端引物：TCCTTCTAACCCCATTCATATAACA；5′端引物：TAGTATTATGGGTATGGTGTTGGTTG，3′端引物：AAACCACCACTTTTTAATCTAACCC。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為493bp和497bp）、SAP反應(yīng)、T切/RNase A消化反應(yīng)、樹(shù)脂純化等?；騿?dòng)子區(qū)甲基化水平=CpG片段數(shù)/（CpG片段數(shù)+CpA片段數(shù)）。將甲基化水平＜30%為低甲基化，30%～70%為部分甲基化，＞70%為高甲基化［19］，觀察CpG位點(diǎn)的甲基化水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；ATLI相關(guān)影響因素分析采用Logistic回歸；2組間甲基化水平比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 單因素分析結(jié)果2組BMI、婚姻狀況、文化程度、職業(yè)、等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在吸煙、飲酒史上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 CYP2E1和GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平CYP2E1、GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)均存在1個(gè)CpG島，共包含39個(gè)CpG位點(diǎn)（9，30），CpG位點(diǎn)數(shù)目分別為9、23個(gè)，總體檢出率82.05%（32/39），見(jiàn)圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，34.38%的CpG位點(diǎn)平均甲基化水平＜30%，15.63%的CpG位點(diǎn)平均甲基化水平＞70%。

CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)9個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化水平為74.11%，其中CpG_8甲基化平均水平為41.82%，另外8個(gè)位點(diǎn)的平均甲基化水平在69.76%～87.55%。肝損傷組啟動(dòng)子區(qū)9個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化為71.26%，其中CpG_4.5.8位點(diǎn)的平均甲基化水平處于30%～70%，CpG_1.2.3.6.7.9位點(diǎn)的平均甲基化水平＞70%。對(duì)照組啟動(dòng)子區(qū)9個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化為75.53%，其中CpG_1.2.3.8位點(diǎn)的平均甲基化水平處于30%～70%，CpG_4.5.6.7.9位點(diǎn)的平均甲基化水平＞70%，最高達(dá)86.81%。肝損傷組CpG_1.2.3平均甲基化水平高于對(duì)照組（81.26%vs 69.63%），其他8個(gè)位點(diǎn)的平均甲基化水平均對(duì)照組高于肝損傷組。

表1 本組結(jié)核病患者單因素結(jié)果分析[n（%）]]Table1 General data on the 93 tuberculosis patients n（%）

GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)23個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化水平為19.86%，肝損傷組和對(duì)照組分別為18.16%、20.71%，均為低甲基化。CpG_2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、19、20、21、28、29共15個(gè)CpG位點(diǎn)平均甲基化水平均低于30%，最低甲基化水平為0.17%；其他8個(gè)CpG位點(diǎn)均呈現(xiàn)部分甲基化狀態(tài)，最高甲基化水平為59.03%。見(jiàn)圖1。

圖1 CYP2E1和GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)數(shù)量及反向序列分布Figure 1 Number and distribution of the CpG islands in the CYP2E1 and GSTM1 promoter regions of the tuberculosis patients

2.3 CYP2E1和GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與ATLI的關(guān)系2組CYP2E1_CpG_1-6位點(diǎn)及總體甲基化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明本組蒙古族結(jié)核病患者ATLI與CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平有關(guān)。2組GSTM1_CpG_13、14、18位點(diǎn)甲基化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)總體甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明本組GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與蒙古族結(jié)核病患者ATLI的發(fā)生無(wú)關(guān)，見(jiàn)表2。

2.4 ATLI相關(guān)影響因素Logistic回歸分析將上述單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素全部納入Logistic回歸模型。以分組為應(yīng)變量，吸煙、飲酒、CYP2E1、GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平4個(gè)因素為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，飲酒、CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與蒙古族結(jié)核病患者ATLI發(fā)生有關(guān)（P＜0.05），調(diào)整OR（95%CI）分別為5.329（1.442～19.697） 、0.312（0.165～0.591） 。見(jiàn)表3。

表2 結(jié)核病患者CYP2E1、GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平比較（xˉ± s）Table 2 Methylation levels of the CpG islands in the CYP2E1 and GSTM1 promoter regions of the tuberculosis patients in the ATLI and non-ATLI control groups（xˉ± s）

表3 結(jié)核病患者ATLI相關(guān)影響因素多因素Logistic回歸分析Table 3 Results of multivariate logistic regression analysis on the risk factors of ATLI in the tuberculosis patients

3 討 論

目前，關(guān)于抗結(jié)核藥物性肝損傷的研究多集中在基因多態(tài)性，而在表觀遺傳學(xué)方面研究短缺，故本研究從表觀遺傳學(xué)中較為重要的DNA甲基化方面進(jìn)行研究，為降低ATLI的發(fā)生率，減少病死率提供更多信息。

本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于部分甲基化（30%～70%），CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化（＞70%）是ATLI的保護(hù)因素，可以降低ATLI發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，提示蒙古族結(jié)核患者CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)部分甲基化（30%～70%）可以增加ATLI的風(fēng)險(xiǎn)，甲基化水平越低發(fā)生ATLI的風(fēng)險(xiǎn)越高。Zhang等［20］發(fā)現(xiàn)漢族CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化患者發(fā)生ATLI的危險(xiǎn)性是低甲基化者的4.390倍，這與本研究部分甲基化患者比高甲基化患者發(fā)生ATLI的危險(xiǎn)性更高的結(jié)果不一致。原因?yàn)椋孩俜N族、地域差異，蒙古族結(jié)核患者中的確存在這種現(xiàn)象；②ATLI的判定標(biāo)準(zhǔn)不同，本研究肝損傷的診斷根據(jù)《抗結(jié)核藥物所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》［18］；Zhang等［20］診斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)源于1990年在巴黎召開(kāi)的國(guó)際共識(shí)會(huì)議；③實(shí)驗(yàn)方法不同，本研究基于Mass ARRAY平臺(tái)對(duì)藥物代謝酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行定量檢測(cè)，范圍為0～100%；而Zhang等［20］采用甲基化特異性PCR法對(duì)藥物代謝酶基因甲基化進(jìn)行甲基化和非甲基化狀態(tài)的定性檢測(cè)；④本研究樣本量不足。另外，Shen等［21］發(fā)現(xiàn)ATLI大鼠全基因組甲基化水平低于正常組，且CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)了異常的甲基化改變。因此本研究認(rèn)為CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化者發(fā)生ATLI的危險(xiǎn)性可能低于部分甲基化者。

本研究單因素分析和多因素Logistic回歸分析均未發(fā)現(xiàn)GSTM1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與ATLI的發(fā)生有關(guān)，結(jié)合本研究前期對(duì)GSTM1基因多態(tài)性與ATLI關(guān)系的研究結(jié)果同樣未發(fā)現(xiàn)GSTM1基因多態(tài)性與ATLI的發(fā)生有關(guān)。故GSTM1基因無(wú)論從遺傳學(xué)還是表觀遺傳學(xué)都與ATLI的發(fā)生無(wú)關(guān)。

目前，有關(guān)GSTM1基因甲基化與ATLI的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。但研究發(fā)現(xiàn)，許多GSTs類基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化影響著基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。多項(xiàng)研究表明，GSTP1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化會(huì)抑制基因表達(dá)，從而增加了肝損傷發(fā)生的可能性［22］，如王錦紅［23］發(fā)現(xiàn)，肝癌早期就可檢測(cè)出基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的異常改變，并作出GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能參與了肝炎的發(fā)生，并參與了肝癌發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。同樣，賀蕾［24］發(fā)現(xiàn)GSTP1基因多態(tài)性與ATLI的發(fā)生無(wú)關(guān)；其啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與ATLI的發(fā)生有關(guān)，具有高甲基化特征的患者是發(fā)生ATLI的高危人群?？梢?jiàn)GSTs基因各亞家族的與ATLI之間關(guān)系的研究并不完全一致，需要我們進(jìn)一步探索，尋求更多證據(jù)來(lái)證明兩者之間真正的關(guān)系。

發(fā)病機(jī)制方面，CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而抑制CYP2E1酶活性，在異煙肼的代謝途徑主要表現(xiàn)為：①異煙肼通過(guò)NAT2乙?；纬梢阴．悷熾?，經(jīng)水解生成異煙酸和乙酰肼，NAT2基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化抑制其酶活性，使其不能發(fā)揮功能，從而降低了抗結(jié)核藥物的代謝分解能力，增加了肝損傷的可能性；②通過(guò)酰胺酶作用水解生成異煙酸和肼。肼可以被繼續(xù)乙?；癁橐阴ｋ潞投阴ｋ?。其中，肼和乙酰肼是造成肝損傷的主要原因，乙酰肼經(jīng)CYP酶作用催化產(chǎn)生毒性中間代謝產(chǎn)物，它們與不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞的損害［25］，CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化同樣會(huì)抑制其酶活性，這樣乙酰肼由于沒(méi)有酶的催化，減少了毒性代謝產(chǎn)物的形成，降低肝損傷發(fā)生的可能性。研究顯示GSTs被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的自由基清除劑，主要參與化學(xué)物質(zhì)的解毒過(guò)程［26］，上述形成的毒性代謝產(chǎn)物可進(jìn)一步被肝內(nèi)的GSTs結(jié)合，降解肼和乙酰肼的生成，減輕對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用［27］。

綜上所述，本研究揭示了蒙古族CYP2E1、GSTM1基因甲基化水平與ATLI之間的關(guān)系，加深了對(duì)蒙古族結(jié)核病患者ATLI發(fā)病機(jī)制中基因甲基化的認(rèn)識(shí)，提示CYP2E1基因甲基化可作為ATLI發(fā)生的生物標(biāo)志物應(yīng)用于結(jié)核病患者ATLI的預(yù)防和控制。