纖維連接蛋白1在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

孫 陽(yáng)，趙春臨

0 引 言

胃癌作為世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中居于第2位［1-2］。中國(guó)胃癌的發(fā)病率為第 2（32.23/100000），死亡率為第 3（23.90/100000）［3］。盡管手術(shù)結(jié)合放療、化療和靶向治療延長(zhǎng)了生存時(shí)間，但晚期胃癌患者的預(yù)后依然很差。關(guān)鍵因素是轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚，沒(méi)有有效的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。因此，從分子水平探討胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于延長(zhǎng)晚期胃癌患者的生存時(shí)間具有重要意義。纖維連接蛋白（Fibronectin 1，F(xiàn)N1）在細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、形態(tài)發(fā)生、分化和癌變中起重要作用［4］。上皮腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）與癌細(xì)胞向周圍微環(huán)境的進(jìn)展和侵襲以及化學(xué)抗性表型有關(guān)，在EMT過(guò)程中上皮癌細(xì)胞中上調(diào)的FN1已被用作檢測(cè)癌癥EMT表型的間充質(zhì)標(biāo)記［5］。研究表明在癌癥（如乳腺癌和肺癌）中與其整合素受體α5β1結(jié)合來(lái)激活PI3K/Akt途徑［6-7］。FN1參與癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚，且FN1在胃癌中的表達(dá)和作用報(bào)道較少。因此，本研究利用在線腫瘤相關(guān)基因表達(dá)匯編（the gene expression omnibus，GEO）和癌癥和腫瘤基因表達(dá)圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)，Kaplan Meier plotter在線生存分析、基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）等方法分析FN1在胃癌組織中的表達(dá)、臨床病理關(guān)系、預(yù)后和可能參與的信號(hào)通路。

1 資料與方法

1.1 資料收集從人類GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE54129和GSE29272數(shù)據(jù)（原始數(shù)據(jù)運(yùn)用TAC4.0進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化）。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載TCGA.STAD.sampleMap/HiSeqV2_PANCA數(shù)據(jù)（已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理）。使用Kaplan Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）在線生存分析數(shù)據(jù)中的胃癌GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析。

1.2 數(shù)據(jù)集篩選GSE54129和GSE29272數(shù)據(jù)臨床信息不全僅用于mRNA表達(dá)對(duì)比分析。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中僅分析臨床資料和生存信息完整的患者，TCGA數(shù)據(jù)共納入胃癌患者358例，中位年齡67歲，男230例、女128例。TNM分期：Ⅰ期49例、Ⅱ期115例、Ⅲ期160例、Ⅳ期34例。根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)FN1表達(dá)分為：低表達(dá)（＜-0.475）、中表達(dá)（-0.475～1.036）、高表達(dá)（＞1.036）。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)來(lái)自GEO下載的mRNA數(shù)據(jù)，共876例胃癌用于生存分析。

1.3 基因集富集分析采用GSEA3.0版本軟件進(jìn)行分析。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)中FN1的表達(dá)水平分為低表達(dá)（＜-0.898）和高表達(dá)（＞1.271）。從GSEA網(wǎng)站的MSIGDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了C6AL.V2.2.GMT和C2.CP.KEG.V5.2.GMT數(shù)據(jù)集作為參照基因集，分析FN1高表達(dá)（＜-0.898）和低表達(dá)（＞1.271）對(duì)各參照基因集的影響。運(yùn)行GSEA設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1000次。在GSEA中P＜0.05且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.25的基因集為顯著富集基因集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織FN1表達(dá)GSE54129數(shù)據(jù)中胃癌患者111例和正常胃黏膜21例，變異倍數(shù)8.86（P＜0.01）。GSE29272 數(shù)據(jù)中134對(duì)癌和癌旁組織，變異倍數(shù) 4.01（P＜0.01）。TCGA數(shù)據(jù)中胃癌癌組織中FN1的表達(dá)明顯高于癌旁組織（0.120 vs-1.167），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 FN1表達(dá)與臨床病理學(xué)相關(guān)性TCGA數(shù)據(jù)中FN1表達(dá)水平與年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、組織學(xué)分型相關(guān)（P＜0.001）。腫瘤惡性程度越高，F(xiàn)N1表達(dá)越高，見(jiàn)表1。

2.3 FN1表達(dá)與胃癌預(yù)后TCGA數(shù)據(jù)集和Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)（包括GEO數(shù)據(jù)）的生存分析表明，TCGA數(shù)據(jù)集中FN1低、中、高表達(dá)的中位生存時(shí)間分別為63.5、55.7和39.4個(gè)月，低表達(dá)和高表達(dá)者中位生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)N1高表達(dá)者中位生存時(shí)間短于低表達(dá)者（P＜0.01）。即FN1表達(dá)越高，預(yù)后越差。見(jiàn)圖1。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，F(xiàn)N1的表達(dá)是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素（HR=0.480，95%CI：0.336～0.686）。見(jiàn)表2。

2.4 FN1的功能基因集富集GSEA法結(jié)果提示FN1高表達(dá)樣本富集到KRAS（FDR=0.0025）、P53（FDR=0.0052）、TGF-β（FDR=0.0052）、細(xì)胞黏附（FDR=0.0）、細(xì)胞外基質(zhì)（FDR=0.0043）、骨架蛋白調(diào) 控（FDR=0.0057）等 基 因 集（P 均 ＜0.01）。見(jiàn)圖2。

表1 胃癌患者中FN1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 1 Relationship between the expression of FN1 and clinicalpathological characteristics n（%）

圖1 胃癌患者FN1表達(dá)與胃癌預(yù)后生存分析Figure 1 Correlation of FN1 expression and prognosis in gastric cancer

表2 胃癌患者不同預(yù)后因素的單變量和多變量分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of different prognostic factors in GC patients

圖2 胃癌患者GSEA分析FN1的相關(guān)富集基因集Figure 2 GSEA analysis of FN1 enriched gene sets

3 討 論

FN1是一種參與細(xì)胞黏附、遷移及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的糖蛋白，并且FN1是多種癌細(xì)胞形成和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子［9-19］，目前FN1已被用作檢測(cè)EMT標(biāo)記物［12］。本研究的實(shí)驗(yàn)方法和趙文甲等［20］和劉健等［21］的實(shí)驗(yàn)方法一致，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析FN1在胃癌中的作用，結(jié)果顯示FN1在胃癌中表達(dá)升高，這與Xu等［22］報(bào)道一致。Cai等［13］揭示了在CRC（結(jié)直腸癌）患者中FN1表達(dá)水平與年齡，淋巴血管侵犯和存活時(shí)間顯著相關(guān)，本研究同樣顯示FN1在胃癌中與浸潤(rùn)深度和分化程度相關(guān)。臨床研究還表明，F(xiàn)N1的高表達(dá)與腎癌的生存率低密切相關(guān)［14］，本研究發(fā)現(xiàn)FN1在胃癌中也是如此。本研究還顯示不同組織學(xué)分型表達(dá)具有顯著差異性，在其它腫瘤中并未見(jiàn)報(bào)道，可以進(jìn)行深一步研究關(guān)于組織學(xué)的差異性。

信號(hào)通路是惡性腫瘤的研究重點(diǎn)，現(xiàn)在研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制主要通過(guò)研究信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，與腫瘤相關(guān)的有很多，如JAK-STAT信號(hào)通路、p53信號(hào)等。FN1通過(guò)調(diào)節(jié)A431-III細(xì)胞中MMP-9、MMP-1、整合素β1和β3通路蛋白［11］，VEGF通路［15］，PI-3K/Akt2通路［18］等。有研究表明FN1過(guò)表達(dá)可以通過(guò)激活MMP2/MMP9（EMT通路）途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲［21-22］。本研究采用GSEA的方法研究FN1參與的信號(hào)通路，本研究采用GSEA法研究FN1的表達(dá)與KRAS、P53、TGF-β、細(xì)胞黏附、ECM、細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)途徑有關(guān)。推測(cè)FN1可能通過(guò)參與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移而影響生存。證實(shí)FN1可作為預(yù)后指標(biāo)，可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。由于本研究利用TCGA提供的第二代mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FN1在mRNA水平上的表達(dá)進(jìn)行分析，因此不能完全反映蛋白表達(dá)的結(jié)果。然而，樣本量大、臨床資料完整、可靠性高，在一定程度上具有代表性意義，為進(jìn)一步的研究提供線索和依據(jù)。在隨后研究中，將進(jìn)一步使用IHC、RTPCR和WB進(jìn)一步驗(yàn)證和分析其預(yù)后意義、作用及機(jī)制。

綜上所述，本研究利用TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)出胃癌組織FN1表達(dá)高于癌旁組織，F(xiàn)N1的高表達(dá)是胃癌預(yù)后不良的因素，可作為預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物；FN1高表達(dá)導(dǎo)致KRAS、P53、TGF-β、ECM、細(xì)胞黏附和細(xì)胞骨架蛋白基因通路異?？赡苁瞧渥饔脵C(jī)制。