具有除草活性的生防菌株GD-9發(fā)酵條件優(yōu)化及菌劑制備

馬永強(qiáng) 朱海霞

摘要 為了明確具有除草活性的生防菌株GD9發(fā)酵過程中各因子的配比和最優(yōu)條件，采用單因素試驗(yàn)對菌株最適碳源、氮源、載體、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行了篩選，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了碳源、氮源、初始含水量、接種量、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度7種因素對菌株活菌數(shù)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明菌株GD9最佳固態(tài)發(fā)酵條件為：氮源NaNO3 58.4 mg/g，碳源葡萄糖48.4 mg/g，培養(yǎng)基質(zhì)最適初始含水量為258 mg/g，最適接種量為0.26 mL/g，初始 pH 7.6，最佳培養(yǎng)時(shí)間147.8 h，最佳培養(yǎng)溫度30.7℃，最適宜的載體為黏土，分散劑為聚乙烯醇，穩(wěn)定劑為膨潤土，潤濕劑為糊精。通過發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果制備生防菌株GD9的固體菌劑，該研究為菌劑的商品化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 生防菌株; 除草活性; 發(fā)酵條件; 菌劑制備

中圖分類號： S 451.1， S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018255

Abstract In order to clarify the proportion and optimal conditions of various factors in the fermentation process of biocontrol strain GD9 with herbicidal activity， the single factor experiment was performed to screen the optimal carbon source， nitrogen source， carrier and solid fermentation substrate of the strain. The orthogonal experiment design was used to study the influences of carbon source， nitrogen source， initial water content， inoculation amount， initial pH value， culture time and culture temperature on the colony number of the strain. The experimental results showed that the optimal solid state fermentation conditions of strain GD9 were Nsource NaNO3 58.4 mg/g， Csource glucose 48.4 mg/g， 258 mg/g of initial water content of the culture medium， 0.26 mL/g of inoculation amount， the initial pH 7.6， 147.8 h and 30.7℃ of culture time and temperature， respectively. The optimal carrier， dispersant， stabilizer and wetting agent were clay， polyvinyl alcohol， bentonite and dextrin. The solid microbial inoculum of biocontrol strain GD9 was prepared through fermentation test results. This study laid a foundation for the commercial production of the microbial inoculum.

Key words biocontrol strain; herbicidal activity; fermentation conditions; preparation of microbial inoculum

農(nóng)田雜草是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，直接或間接地影響著農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量、產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前在生產(chǎn)上，農(nóng)田雜草的防治一般采用人工防除和化學(xué)防除等方法。人工除草效率相對低、成本高，而長期采用化學(xué)防除易使雜草易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致用藥量增加、防效降低、環(huán)境污染等弊端[23]。與化學(xué)除草劑相比，微生物除草劑具有許多潛在的優(yōu)勢：（1）這類除草劑作用位點(diǎn)新穎，是現(xiàn)有化學(xué)除草劑未涉及的，有利于雜草的抗性治理;（2）這些天然產(chǎn)物可以為新的除草劑合成方案提供線索;（3）在低濃度時(shí)這些產(chǎn)物便可發(fā)揮較高生物活性;（4）微生物天然產(chǎn)物在環(huán)境中的半衰期比合成農(nóng)藥短得多，易迅速降解或解毒，因此登記試驗(yàn)比化學(xué)農(nóng)藥所用的時(shí)間短、資金少;（5）植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、發(fā)酵技術(shù)、分子遺傳學(xué)和基因工程最新發(fā)展把生產(chǎn)昂貴的天然產(chǎn)物防除雜草變成了現(xiàn)實(shí)[46]。微生物繁殖快，能廣泛利用農(nóng)副產(chǎn)品、工農(nóng)業(yè)廢水和廢棄物等進(jìn)行生產(chǎn)，微生物除草劑被認(rèn)為是綠色、無公害農(nóng)藥，其防治對象不易產(chǎn)生抗藥性，且藥劑對農(nóng)田生態(tài)環(huán)境影響小，有利于保護(hù)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，已成為農(nóng)田用藥中的首選藥劑[7]。

微生物除草劑的研究起步很晚，一些關(guān)鍵技術(shù)還沒有解決，許多研究還處在試驗(yàn)階段，真正商品化的很少，即使有，也只是作為化學(xué)除草劑的補(bǔ)充。但隨著對微生物除草劑這一新的研究領(lǐng)域的認(rèn)識不斷加深，相信它一定會成為未來除草劑市場的主流[8]。近20多年來，國外已成功地開發(fā)了一些微生物除草劑，并取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益。雙丙氨膦（bialaphos）是第一個(gè)被開發(fā)成商品除草劑的放線菌Streptomyces viridochromogenes的代謝產(chǎn)物。雙丙氨膦是一種可殺單子葉和雙子葉植物的非選擇性除草劑，常用于非耕地和果園防除一年生或多年生雜草，已在日本銷售[9]。目前微生物除草劑已經(jīng)越來越受到重視，其研究不僅僅局限在潛力菌株的篩選，更多的菌劑已被開發(fā)出來，各種助劑的使用使微生物除草劑正向?qū)I(yè)化和規(guī)范化發(fā)展[10]。

鏈霉菌Streptomyces sp. GD9菌株是分離自大刺兒菜根系土壤中的一株放線菌，前期大量試驗(yàn)表明該菌株對一年生禾本科雜草野燕麥具有較好的致病作用，對野燕麥種子的萌發(fā)抑制率達(dá)90.1%，具有開發(fā)生防除草劑的潛力。本研究為了明確菌株GD9發(fā)酵相關(guān)碳源、氮源、載體、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)、初始含水量、接種量、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等因素對菌株活菌數(shù)的影響，為該菌株除草菌劑的研發(fā)和商品化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：GD9是分離自大刺兒菜根系土壤中的一株放線菌，保存于青海省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂16～18 g、蒸餾水1 L、pH 7.4～7.6。

高氏一號液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蒸餾水1 L、pH 7.4～7.6。

碳源：可溶性淀粉、麥麩、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麥粉。

氮源：大豆粉、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素。

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)：羊糞、菜籽餅、小麥秸稈、麥麩、玉米粉。

載體及助劑：可溶性淀粉、CaCO3、糊精、羧甲基纖維素、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉、拉開粉、十二烷基硫酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、白炭黑、膨潤土、輕質(zhì)碳酸鈣、聚乙烯醇、腐殖酸、硅藻土、吐溫、沙子、黏土、爐渣。

1.2 菌株活化

制備高氏一號培養(yǎng)基，倒平板使其冷卻、凝固待用;從冰箱中取出4℃條件下保存的菌株，使其恢復(fù)到室溫狀態(tài)， 用接種針挑取適量菌絲在高氏培養(yǎng)基上劃線，之后放入28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d，挑取其中部分菌絲接種到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)此步驟2～3次，從而得到生長良好的菌落（圖1）。

1.3 最適碳、氮源的篩選

用高氏1號為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行碳源篩選試驗(yàn)，將可溶性淀粉、麥麩、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麥粉作為碳源，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的量加入高氏1號培養(yǎng)基中，攪拌均勻，121℃高壓滅菌30 min，在超凈工作臺中倒入滅菌的培養(yǎng)皿中待其冷卻凝固，將活化后生長旺盛的菌落打8 mm菌餅， 菌絲面朝下接種于培養(yǎng)基中央，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，定期測量菌落直徑和孢子懸浮液的OD值。以不添加碳源的培養(yǎng)基為對照組，選出菌落生長好的碳源。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

用高氏1號為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行氮源篩選試驗(yàn)，將大豆粉、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素作為氮源，按2%的量加入高氏1號培養(yǎng)基中，用不添加氮源的培養(yǎng)基作為對照組，以同樣的方法選出菌落生長好的氮源。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

孢子懸浮液OD值測定：用載玻片將菌落上的孢子輕輕刮下，加入5 mL超純水，用單層干凈無菌紗布過濾除去菌絲，得到孢子懸浮液。用分光光度計(jì)在600 nm波長下測其OD值，選出產(chǎn)孢量最佳的碳源[12]。以同樣的方法，選出產(chǎn)孢量最高的氮源。

1.4 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)篩選

選用菜籽餅、玉米粉、羊糞、麥麩和小麥秸稈等價(jià)格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品下腳料作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。每瓶中小麥秸稈10 g、羊糞15 g、菜籽餅25 g、玉米粉 25 g、麥麩25 g分別放入150 mL的三角瓶中，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的量加入所篩選出來的最適碳氮源、適量的自來水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?jīng)121℃、30 min高溫高壓滅菌后，冷卻到室溫。在超凈工作臺里每瓶接種菌液5 mL后在28℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，觀察記錄菌落生長狀況，以不接菌液的固態(tài)基質(zhì)為空白對照;用分光光度計(jì)測定經(jīng)過濾的菌懸液OD值，篩選出產(chǎn)孢量高的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件

采用L25（57）正交表，測定碳源、氮源、初始含水量、接種量、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度7個(gè)因素對菌株GD9活菌數(shù)的影響，每種因素各取5個(gè)水平（表1），對菌株GD9固態(tài)發(fā)酵條件相關(guān)上述7個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)得到49個(gè)處理（表2）。根據(jù)最適碳氮源和固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選結(jié)果，選用麥麩∶羊糞=1∶1作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，葡萄糖作為碳源，硝酸鈉作為氮源，根據(jù)配方配制不同處理的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121℃滅菌30 min，冷卻到室溫后，依次接入GD9發(fā)酵液，攪拌均勻，置于生化培養(yǎng)箱中28℃靜置培養(yǎng)。不同處理自然風(fēng)干、粉碎，平板菌落計(jì)數(shù)法測定不同處理的活菌數(shù)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.6 載體篩選及劑型制備

用高氏1號為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行載體單因素試驗(yàn)，將初篩出來的載體硅藻土、膨潤土、拉開粉、白炭黑及助劑羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、木質(zhì)素磺酸鈉等按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的量加入高氏1號培養(yǎng)基中，攪拌均勻，121℃高壓滅菌30 min，在超凈工作臺中將含不同載體或助劑的培養(yǎng)基倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固，將活化后生長旺盛的菌落打8 mm菌餅， 菌絲面朝下接種于培養(yǎng)基中央，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，定期測量菌落直徑和孢子懸浮液OD值。以不添加載體的基質(zhì)為對照組，選出菌落生長好的載體。每組設(shè)置2個(gè)重復(fù)。根據(jù)前幾步所篩選的最適碳氮源、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)及正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行菌劑的研制。在最適固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中加適量的水、2%的碳氮源，121℃、30 min高溫高壓滅菌后，冷卻到室溫。每個(gè)白盆0.7 kg基質(zhì)，接種菌液160 mL，用手?jǐn)嚢杈鶆蚝笥帽ｕr膜封口室溫培養(yǎng)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

全部數(shù)據(jù)分析在DPS 6.50 數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適碳氮源篩選

分別于培養(yǎng)第5、7 和9天測定菌株GD9在不同碳氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑和孢子懸浮液OD值，結(jié)果見表3、表4。GD9在葡萄糖培養(yǎng)基上菌落生長最快，菌落直徑最大，葡萄糖培養(yǎng)基與其他碳源處理孢子懸浮液OD值之間存在極顯著性差異，在可溶性淀粉和麥麩培養(yǎng)基上菌落直徑略小，在小麥粉培養(yǎng)基上最小。在硝酸鈉培養(yǎng)基上菌落直徑最大，且與其他氮源處理孢子懸浮液OD值之間存在極顯著性差異;尿素培養(yǎng)基完全抑制菌落生長。結(jié)合菌落形態(tài)、菌落直徑和孢子懸浮液OD值，最終篩選最適碳源為葡萄糖，最適氮源為硝酸鈉。

2.2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)篩選

利用孢子懸浮液分光光度值判斷不同固態(tài)基質(zhì)的產(chǎn)孢量大小。從表5可以看出，菌株GD9生長較好的固態(tài)基質(zhì)為：羊糞>麥麩>菜籽餅>小麥秸稈>玉米粉;孢子懸浮液OD值方差分析結(jié)果表明，羊糞培養(yǎng)基上GD9產(chǎn)孢量與其他基質(zhì)間存在極顯著差異，菜籽餅、玉米粉、麥麩和小麥秸稈之間不存在顯著性差異。因此，GD9菌株的最適產(chǎn)孢固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)為羊糞。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件

菌株GD9固態(tài)發(fā)酵的正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表6）表明，試驗(yàn)的7種因素中極差R值從大到小依次為：氮源（4.72）、碳源（3.69）、初始含水量（3.51）、培養(yǎng)溫度（3.48）、接種量（2.85）、初始pH（2.59）、培養(yǎng)時(shí)間（2.56）。因此，影響菌株GD9固態(tài)發(fā)酵條件的因素作用由大到小依次為：氮源>碳源>初始含水量>培養(yǎng)溫度>接種量>初始pH>培養(yǎng)時(shí)間。從各水平的統(tǒng)計(jì)A值比較來看，菌株GD9的最佳固態(tài)發(fā)酵條件為：氮源硝酸鈉58.4 mg/g、碳源葡萄糖48.4 mg/g、初始含水量258 mg/g、接種量0.26 mL/g、初始 pH 7.6、培養(yǎng)時(shí)間147.8 h、培養(yǎng)溫度30.7℃。

2.4 載體及助劑篩選

表7可以看出：黏土培養(yǎng)基上菌落生長最快，菌落直徑最大，且黏土培養(yǎng)基上得到的孢子懸浮液OD值最高，與其他載體培養(yǎng)基的孢子懸浮液OD值之間存在極顯著差異，膨潤土、聚乙烯醇及糊精處理的次之;拉開粉和海藻酸鈉載體處理的孢子懸浮液間不存在顯著差異，完全抑制菌絲生長，菌落直徑為8.0 mm，孢子懸浮液OD值為0。其余載體處理孢子懸浮液OD值之間均存在極顯著差異。

綜合菌落形態(tài)、菌落直徑和孢子懸浮液OD值得出，菌株GD9最適載體和助劑為黏土、膨潤土、聚乙烯醇、糊精。

2.5 劑型研制

根據(jù)所篩選的最適碳氮源、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)及正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行菌劑的研制。在羊糞∶麥麩=1∶1的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中按質(zhì)量分?jǐn)?shù)加25.8%水、2%碳氮源（葡萄糖、硝酸鈉），121℃、30 min高溫高壓滅菌后，冷卻到室溫。每個(gè)白盆0.7 kg基質(zhì)，接種菌液160 mL，攪拌均勻后用保鮮膜封口室溫培養(yǎng)。

將GD9菌劑按質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、黏土30%、膨潤土1%、糊精3%、聚乙烯醇6%的比例混合，按照一定的工藝，初步試驗(yàn)探索得到穩(wěn)定性強(qiáng)、可均勻分散的易溶于水的可濕性粉劑。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對具有除草活性的菌株GD9的活化，最適碳氮源、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)、載體的篩選以及采用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件。得出以下結(jié)論：

以菌落直徑和孢子懸浮液OD值為指標(biāo)篩選最適碳氮源以及載體和助劑，篩選出最適碳源為葡萄糖，最適氮源為硝酸鈉，最適載體及助劑為黏土、聚乙烯醇、膨潤土、糊精。

用菌落計(jì)數(shù)法和孢子懸浮液OD值測定法對最適固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)和最優(yōu)培養(yǎng)條件的篩選中，篩選出最適固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)為羊糞;影響菌株GD9固態(tài)發(fā)酵條件的因素作用由大到小依次為：氮源>碳源>初始含水量>培養(yǎng)溫度>接種量>初始pH>培養(yǎng)時(shí)間。菌株GD9的最佳固態(tài)發(fā)酵條件為：氮源硝酸鈉58.4 mg/g、碳源葡萄糖48.4 mg/g、初始含水量258 mg/g、接種量0.26 mL/g、初始pH7.6、培養(yǎng)時(shí)間147.8 h、培養(yǎng)溫度30.7℃。

生防菌固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的選取一般都是容易獲得、價(jià)格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品下腳料，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上既綠色、無公害，又可保護(hù)環(huán)境，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求[14]。本研究中生防菌株GD9的固態(tài)發(fā)酵適用于大批量生產(chǎn)，得到的菌劑易保存，方便儲存和運(yùn)輸。

微生物除草劑的開發(fā)應(yīng)用比化學(xué)農(nóng)藥的開發(fā)存在更大的難度，其藥效受外界環(huán)境影響很大，所以選擇合適的載體助劑是生物農(nóng)藥開發(fā)的關(guān)鍵。生物農(nóng)藥助劑的功能，就在于改善農(nóng)藥的一些物理或化學(xué)性能，最大限度地發(fā)揮藥效及安全施藥[15]。

本試驗(yàn)已篩選出了最適合的載體及助劑，后續(xù)試驗(yàn)可將GD9菌劑60%、黏土30%、膨潤土1%、糊精3%、聚乙烯醇6%的比例進(jìn)行混合，按照一定的工藝，初步試驗(yàn)探索得到穩(wěn)定性強(qiáng)、可均勻分散的易溶于水的可濕性粉劑。最終篩選研制出防除效果較好的除草劑劑型，為微生物除草劑的研究提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 梁巧玲，馬德英.農(nóng)田雜草綜合防治研究進(jìn)展[J].雜草科學(xué)，2007（2）：3536.

[2] 崔新倩.花生田雜草化學(xué)防除現(xiàn)狀及趨勢[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2011，14（12）：156158.

[3] 黃石旺，劉正日，陳和春，等.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中除草劑的危害及對策[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（14）：2829.

[4] CUTLER H G， Perspectives on discovery of microbial phytotoxins with herbicide activity [J]. Weed Technology，1988（2）： 525532.

[5] 丁建清.生物防治——雜草綜合防治的重要內(nèi)容[J].雜草學(xué)報(bào)，1995，9（1）：6064.

[6] 陳燕芳，丁偉，丁吉林，等.天然產(chǎn)物除草劑研究進(jìn)展[J].雜草科學(xué)，2007（2）：15.

[7] LI Yongquan， SUN Ziling， ZHUANG Xiaofeng， et al. Research progress on microbial herbicides [J]. Crop Protection， 2003， 22（2）： 247252.

[8] 仉歡，王開運(yùn).微生物除草劑研究進(jìn)展[J].雜草科學(xué)，2010（2）：18.

[9] 藤森嶺.微生物源農(nóng)藥雜草防除[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)，1993，48（1）：1821.

[10]ZHANG Jinlin， ZHANG Lihui， LIU Yingchao， et al. The herbicidal activity of mutant isolates from Botrytis cinerea[J]. Agricultural Sciences in China， 2006， 5（8）： 622628.

[11]馬娟，董金皋.微生物除草劑與生物安全[J].植物保護(hù)，2006，32（1）：912.

[12]涂璇.辣椒疫霉生防菌篩選及生防菌劑應(yīng)用研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

[13]郭亮，刑曉旭，鄭學(xué)明，等.重鉻酸鉀溶液對細(xì)菌活性的影響[J].山東畜牧獸醫(yī)，2009，30（2）：48.

[14]曹紅娣.農(nóng)藥可濕性粉劑生產(chǎn)工藝的改進(jìn)[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2005（6）：7779.

[15]張劍，董曄欣，張金林，等.一株具有高除草活性的真菌菌株[J].菌物學(xué)報(bào)，2008，27（5）：645651.

（責(zé)任編輯：田 喆）