左氧氟沙星耐藥小鼠模型的建立

崔煦然，丁軍穎，趙京霞，郭玉紅，崔曉蘭，劉清泉*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京市中醫(yī)研究所，北京 100010；3.中醫(yī)感染性疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100010；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

細(xì)菌性肺炎是常見的重癥肺炎。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是引起醫(yī)院獲得性肺炎和呼吸機(jī)相關(guān)肺炎最多見的革蘭陰性桿菌之一[1]，常見發(fā)生于患有多種基礎(chǔ)疾病或免疫力低下的患者[2-3]。PA耐藥性強(qiáng)，耐藥譜廣，對(duì)多種抗菌藥物表現(xiàn)為天然或獲得性耐藥[4]。1979 年，Cash等[5]以氣管切開注射的方式構(gòu)建了PA致小鼠肺部感染的模型；1994年，童明慶等[6]采用肺炎克雷伯菌攻擊小鼠肺臟造成肺部感染，從而成功地建立了小鼠實(shí)驗(yàn)性支氣管肺炎模型；2009年李建生等[7]采用細(xì)菌滴注和風(fēng)熱刺激結(jié)合模型的方法建立了肺炎克雷伯桿菌肺炎痰熱證模型。這些模型的制備充分證實(shí)了細(xì)菌性肺炎模型的可行性。為了探索PA體內(nèi)耐藥性產(chǎn)生的變化和治療方法，需要建立一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠磉M(jìn)行深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行左氧氟沙星耐藥研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠96只，雌雄各半，體重為(14±1)g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，[SCXK(京)2012-0001]。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中藥研究所生物安全實(shí)驗(yàn)室[SYXK(京)2013-0035]進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過北京市中醫(yī)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，審批編號(hào)：2015010201，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)菌株

PA標(biāo)準(zhǔn)株27853，購(gòu)自ATCC，實(shí)驗(yàn)室傳代1次后，-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器

左氧氟沙星片：第一三共制藥(北京)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：BNO11A1；氯化鈉注射液：石家莊四藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1402261909；MH肉湯：Oxoid公司，批號(hào)1583507；乙醚為普通市售分析純。

生物安全柜：購(gòu)自Thermo公司，型號(hào)ThermoMSC1.8/1.2；電子天平(稱肺重)：購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號(hào)AL204；電子天平(稱體重)：購(gòu)自上海越平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)YP1002；恒溫振蕩培養(yǎng)箱：購(gòu)自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，型號(hào)HZQ-F160；超低溫冰箱：購(gòu)自Thermo公司，型號(hào)ULT Freezer。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 劑量設(shè)計(jì)

(一)左氧氟沙星：人臨床用量為0.3 g/60(kg·d)，試驗(yàn)時(shí)小鼠的等效劑量為0.055 g/(kg·d)。試驗(yàn)中低劑量標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為未達(dá)到臨床左氧氟沙星使用劑量。本次試驗(yàn)采用五個(gè)劑量，即0.0275、0.037、0.055、0.073、0.092 g/(kg·d)，分別為臨床劑量的0.5、0.67、1、1.33、1.67倍，0.0275、0.037 g/(kg·d)即為低劑量。藥物試驗(yàn)時(shí)，小鼠按0.2 mL/10 g體重灌胃給藥。

(二)PA菌液：取一定量的菌液，加入MH營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)時(shí)，采用比濁法調(diào)整菌液至試驗(yàn)濃度。

1.3.2 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×109cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用[8]

取ICR小鼠30只，雌雄各半，按體重等級(jí)隨機(jī)分為正常組、模型組1、左氧氟沙星臨床治療劑量組(左氧氟沙星組1)、低濃度左氧氟沙星刺激3 d組(模型組2)、低濃度左氧氟沙星刺激后治療組(左氧氟沙星組2)，每組6只。各組動(dòng)物麻醉后，以1×109cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6 d，模型對(duì)照組在同等條件下蒸餾水灌胃。各組小鼠每天稱重1次(感染當(dāng)天記為第1天)，并觀察小鼠狀態(tài)，于第7天稱重后，將小鼠斷頸處死，取肺部，記錄肺重。

1.3.3 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×1010cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用[8]

取ICR小鼠36只，雌雄各半，按體重等級(jí)隨機(jī)分為正常組、模型組1、左氧氟沙星臨床治療劑量組1(左氧氟沙星組1)、左氧氟沙星臨床治療劑量組2(左氧氟沙星組2)、低濃度左氧氟沙星刺激3 d組(模型組2)、低濃度左氧氟沙星刺激后治療組(左氧氟沙星組3)，每組6只。各組動(dòng)物用乙醚輕度麻醉，以1×1010cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6 d，模型對(duì)照組在同等條件下蒸餾水灌胃。各組小鼠每天稱重1次(感染當(dāng)天記為第1天)，并觀察小鼠狀態(tài)，于第7天稱重后，將小鼠斷頸處死，取肺部，記錄肺重。

1.3.4 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA重復(fù)感染小鼠肺炎模型的作用8]

取ICR小鼠30只，雌雄各半，按體重等級(jí)隨機(jī)分為正常組、模型組1、左氧氟沙星臨床治療劑量組(左氧氟沙星組1)、低濃度左氧氟沙星刺激3 d組(模型組2)、低濃度左氧氟沙星刺激后治療組(左氧氟沙星組2)，每組6只。各組動(dòng)物用乙醚輕度麻醉，以1×109cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d，模型對(duì)照組在同等條件下蒸餾水灌胃。于第4天，各組動(dòng)物再次用乙醚輕度麻醉，以1×109cfu/mL濃度的菌液滴鼻感染，每只50 μL。感染后1 h，各給藥組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d，模型對(duì)照組在同等條件下蒸餾水灌胃。各組小鼠每天稱重1次(感染當(dāng)天記為第1天)，并觀察小鼠狀態(tài)，于第7天稱重后，將小鼠斷頸處死，取肺部，記錄肺重。

1.3.5 診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]

參照文獻(xiàn)中大鼠細(xì)菌性肺炎模型診斷標(biāo)準(zhǔn)，本次試驗(yàn)小鼠肺炎模型的判定標(biāo)準(zhǔn)確定為

(1)出現(xiàn)行動(dòng)緩慢、毛色暗淡、攝食飲水量減少等；(2)肺組織增重；(3)誘導(dǎo)→給藥組，肺組織增重即視為耐藥性產(chǎn)生。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×109 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用

2.1.1 狀態(tài)觀察

圖1 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×109 cfu/mL)單次感染小鼠體重變化Figure 1 Weight changes in the single PA infection mice (1×109 cfu/mL) plus a low-dose levofloxacin

各組小鼠感染前一般狀態(tài)正常。第2天，模型組1、模型組2、左氧氟沙星組2小鼠表現(xiàn)出蜷縮聚集、行動(dòng)緩慢、毛色暗淡、部分小鼠眼眶可見分泌物，攝食攝水量減少；左氧氟沙星組1小鼠毛色暗淡、行動(dòng)緩慢、攝食攝水量減少。第3天，模型組1、模型組2、左氧氟沙星組2小鼠毛色暗淡、行動(dòng)緩慢、聚集現(xiàn)象不明顯，攝食攝水量增加；左氧氟沙星組1小鼠毛色暗淡、攝食攝水量增加。第4～7天各組小鼠逐漸恢復(fù)，一般狀態(tài)與正常組小鼠相似。正常組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中一般狀態(tài)無明顯變化。

2.1.2 體重觀察

在試驗(yàn)周期內(nèi)，正常組小鼠體重每天均有增長(zhǎng)；各感染組小鼠體重呈現(xiàn) “V”型趨勢(shì)，體重值與正常組比較無顯著性差異；于第3天，各感染組小鼠體重逐漸增長(zhǎng)，增長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致；至第7天，感染組小鼠體重值基本達(dá)到正常小鼠體重水平。結(jié)果如圖1所示。

表1 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×109 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用Table 1 Effect of a low-dose levofloxacin and single PA infection on the mice with pneumonia (1×109 cfu/mL)

注：與正常組比較，##P<0.01。

Note. Compared with the normal group,##P<0.01.

2.1.3 肺指數(shù)檢測(cè)

各感染組小鼠肺指數(shù)均有不同程度的增高，其中模型組1、模型組2肺指數(shù)與正常組比較，均有顯著性差異(P<0.01)；左氧氟沙星組1肺指數(shù)與各組比較，均無顯著性差異；左氧氟沙星組2與模型組2比較，結(jié)果無顯著性差異。結(jié)果如表1所示。

2.2 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×1010 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用

2.2.1 狀態(tài)觀察

各組小鼠感染前一般狀態(tài)正常。第2天，感染組小鼠皆表現(xiàn)出蜷縮聚集、行動(dòng)緩慢、毛色暗淡、部分小鼠眼眶可見分泌物，攝食攝水量減少。第3天，感染各組小鼠毛色暗淡、行動(dòng)緩慢、攝食攝水量不明顯；左氧氟沙星組2小鼠毛色暗淡、攝食攝水量增加。第4～7天各組小鼠逐漸恢復(fù)，左氧氟沙星組1、2小鼠恢復(fù)迅速，至第7天，一般狀態(tài)與正常組小鼠相似。正常組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中一般狀態(tài)無明顯變化。

2.2.2 體重觀察

圖2結(jié)果顯示：在試驗(yàn)周期內(nèi)，正常組小鼠體重每天均有增長(zhǎng)；各感染組小鼠體重呈現(xiàn)先下降后增長(zhǎng)的趨勢(shì)：于第二天體重明顯下降(或者增長(zhǎng)緩慢)，體重值與正常組比較無顯著性差異；于第三天，各感染組小鼠體重逐漸增長(zhǎng)，增長(zhǎng)速度各不相同，其中左氧氟沙星2組小鼠體重增長(zhǎng)速度相對(duì)較快；至第七天，左氧氟沙星組1、2小鼠體重值基本達(dá)到正常小鼠體重水平。

2.2.3 肺指數(shù)檢測(cè)

表2結(jié)果顯示：各感染組小鼠肺指數(shù)均有不同程度的增高；模型組1和模型組2與正常組比較，結(jié)果均有顯著性差異(P<0.01)。左氧氟沙星組1、2肺指數(shù)結(jié)果與模型組比較，均有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)；左氧氟沙星組3與模型組2比較，結(jié)果無顯著性差異。

2.3 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA重復(fù)感染小鼠肺炎模型的作用

2.3.1 狀態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)第1～4天，各組小鼠一般狀態(tài)表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×109cfu/mL)單次感染中小鼠第1～4天表現(xiàn)相似。第5天各感染組小鼠攝食攝水量減少、行動(dòng)緩慢、毛色暗淡，但較第一次感染后狀態(tài)相對(duì)較好。第6～7天，感染組小鼠一般狀態(tài)迅速恢復(fù)，與正常組小鼠相似。正常組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中一般狀態(tài)無明顯變化。

2.3.2 體重觀察

圖1結(jié)果顯示：正常組小鼠體重在試驗(yàn)周期內(nèi)，每天均有增長(zhǎng)；各感染組中，左氧氟沙星組1小鼠體重較正常組比較，增長(zhǎng)趨勢(shì)相似；其他各組小鼠體重整體均呈現(xiàn)“W”型增長(zhǎng)趨勢(shì)：第一次感染后，于第二天體重均有下降，于第三天，各組小鼠體重逐漸增長(zhǎng)，結(jié)果與正常組比較均無顯著性差異。各組小鼠第二次感染后，左氧氟沙星組1小鼠體重較正常組比較，呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；其余各組小鼠，體重均有所下降。于第六天，各組小鼠體重逐漸增長(zhǎng)，結(jié)果與正常組比較均無顯著性差異。

2.3.3 肺指數(shù)檢測(cè)

表5結(jié)果顯示，各感染組小鼠肺指數(shù)均有增高；模型組1和模型組2與正常組比較，均有顯著性差異(P<0.01)。左氧氟沙星組1與模型組1比較，結(jié)果有顯著性差異(P<0.01)；左氧氟沙星組2與模型組2比較，結(jié)果無顯著性差異。

表2 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×1010 cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用Table 2 Effect of a low-dose of levofloxacin on the mice after single PA infection (1×1010 cfu/mL)

注：與正常組比較，##P<0.01。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,##P<0.01. Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

圖2 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×1010 cfu/mL)單次感染小鼠體重變化Figure 2 Effect of a low-dose of levofloxacin on weight changes in mice with single PA infection (1×1010 cfu/mL)

圖3 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA重復(fù)感染小鼠體重變化Figure 3 Effect of a low-dose of levofloxacin on weight changes in mice with repeated PA infection

表3 低濃度左氧氟沙星對(duì)PA重復(fù)感染小鼠肺炎模型的作用Table 3 Effect of a low-dose of levofloxacin on the mice with pneumonia receiving repeated PA infection

注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01。與模型組比較，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,##P<0.01. Compared with the model group,**P<0.01.

3 討論

銅綠假單胞菌(PA)是醫(yī)院感染的重要條件致病菌[10-11]，尤其易發(fā)生ICU 病房和老年人肺部感染[12]，而對(duì)該菌的致病性和耐藥性的研究，理想的動(dòng)物模型是研究基礎(chǔ)。PA屬于致病力低而抗藥性較強(qiáng)的一種桿菌[13]，可從淡水和土壤中分離[4]，廣泛分布于腸道、皮膚及呼吸道[14-15]。近些年，PA 肺炎發(fā)病率呈不斷升高趨勢(shì)[16]。左氧氟沙星是一種臨床廣泛應(yīng)用的氟喹諾酮類藥物[17]，對(duì)PA具有良好的抗菌活性。部分監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，PA對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性現(xiàn)狀仍需重視[18]。左氧氟沙星為氟喹諾酮類藥物之一[19]，具有口服生物利用度高、半衰期長(zhǎng)、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，主要通過抑制細(xì)菌的 DNA旋轉(zhuǎn)酶發(fā)揮抗菌作用[20]。左氧氟沙星對(duì)多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌，有較強(qiáng)的抗菌活性[21]。但隨著細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的加劇，耐左氧氟沙星PA也成為臨床常見菌株[22]。同時(shí)，結(jié)合文獻(xiàn)檢索結(jié)果，細(xì)菌感染模型的構(gòu)建，體外多涉及抗生素刺激誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生、耐藥基因表達(dá)變化等[23-24]；體內(nèi)感染研究多涉及到囊性纖維化模型、燒傷模型等[25]。因此，本次試驗(yàn)旨在探討左氧氟沙星誘導(dǎo)致PA感染小鼠肺炎耐藥模型的建立方法。

小鼠對(duì)多種病原體具有易感性，常用來研究微生物及寄生蟲對(duì)機(jī)體的感染途徑、發(fā)病機(jī)制及綜合防治。實(shí)驗(yàn)中以小鼠肺炎模型為基礎(chǔ)[8]，通過不同的給藥方法、不同感染次數(shù)，模擬不合理用抗生素而致藥效降低甚至無效的臨床問題。通過組間對(duì)照比較分析，以體重和肺指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，旨在探討一種簡(jiǎn)單而可行的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)共涉及三部分：①低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×109cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用中，結(jié)果可推測(cè)出PA感染可致小鼠肺部感染；同時(shí)左氧氟沙星組2與模型組2比較結(jié)果無顯著性差異，提示低劑量左氧氟沙星干預(yù)，對(duì)于該模型小鼠的有效治療產(chǎn)生了影響；結(jié)合左氧氟沙星組1小鼠肺指數(shù)與各組比較均無顯著性差異，猜測(cè)該條件下PA感染的濃度稍低，或者在該實(shí)驗(yàn)條件下左氧氟沙星的治療劑量稍低。②在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，增高PA感染菌液的濃度，并適當(dāng)提高左氧氟沙星的治療劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×1010cfu/mL)單次感染小鼠肺炎模型的作用中，結(jié)果顯示該條件下PA感染小鼠成功；左氧氟沙星組1、2均能顯著性降低模型組肺指數(shù)，表明該方法下左氧氟沙星產(chǎn)生了有效治療作用；結(jié)合左氧氟沙星組3與模型組2比較結(jié)果無顯著性差異，提示低劑量左氧氟沙星干預(yù)，對(duì)于該模型小鼠的有效治療產(chǎn)生了影響。進(jìn)而推測(cè)低濃度左氧氟沙星可致PA感染小鼠肺炎模型對(duì)左氧氟沙星耐藥性產(chǎn)生。③進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，以低濃度菌液重復(fù)感染小鼠，結(jié)果顯示：該條件下PA感染小鼠成功。左氧氟沙星組對(duì)模型小鼠產(chǎn)生了有效治療作用；而左氧氟沙星組2結(jié)果提示低劑量左氧氟沙星干預(yù)，對(duì)于該模型小鼠的有效治療產(chǎn)生了影響。該實(shí)驗(yàn)提示，低濃度左氧氟沙星可致PA感染小鼠肺炎模型對(duì)左氧氟沙星耐藥性產(chǎn)生。此外，各試驗(yàn)中小鼠體重監(jiān)測(cè)結(jié)果中各組小鼠感染PA后，第二天體重較正常組比較雖無顯著性差異，但均有下降趨勢(shì)， 表明PA肺炎模型小鼠感染成功可以參考體重?cái)?shù)據(jù)。

綜合以上信息分析，小鼠滴鼻感染致細(xì)菌肺炎模型操作簡(jiǎn)單，在此條件下通過左氧氟沙星不同給藥量和給藥方式的作用，實(shí)驗(yàn)低濃度左氧氟沙星對(duì)PA(1×1010cfu/mL)單次感染小鼠、低濃度左氧氟沙星對(duì)PA重復(fù)感染小鼠中，動(dòng)物模型可在一定程度上模擬臨床中耐藥產(chǎn)生的現(xiàn)象。但本次實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)指標(biāo)相對(duì)單一，后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)注重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理病理狀態(tài)，以及相關(guān)機(jī)制的研究。