伏九貼膏對(duì)哮喘小鼠NGF/TrKA及相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響

白曉紅，盛小丹，劉 芳，楊鶇祥*

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng)110032； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng)110847)

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，主要以反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶為臨床表現(xiàn)，經(jīng)常會(huì)在夜間和/或凌晨發(fā)作或加劇，呼吸道癥狀的具體表現(xiàn)形式和嚴(yán)重程度具有隨時(shí)間而變化的特點(diǎn)，并常伴有可變的呼氣氣流受限[1]。根據(jù)2010年流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)兒童哮喘平均累積患病率為3.02%[2]。其中年齡在學(xué)齡期前后的兒童的患病率升高最為明顯[3]。對(duì)于兒童哮喘的治療要盡早采取措施。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院應(yīng)用“伏九貼膏”治療兒童哮喘已有悠久的歷史，并取得了較好的臨床效果[4-5]。但其作用機(jī)制尚不明確，所以本實(shí)驗(yàn)?zāi)康募刺接憽胺刨N膏”治療哮喘的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6～8周齡BALB/c小鼠50只，雌雄各半，體重18～20 g，均購(gòu)于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(京)2016-0002]，動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心[SYXK(遼)2013-0009]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用過(guò)程中嚴(yán)格遵守3R原則，并得到了遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[倫理審批號(hào)：21000092017067]。

1.1.2 藥物制備

“伏九貼膏”選用白芥子、延胡索、甘遂、桑白皮、酒大黃、細(xì)辛，按照一定比例共研細(xì)末，鮮姜汁調(diào)成藥餅， 置于4 cm × 4 cm大小的紗布上，中間加麝香制成。其中高劑量含生藥量0.36 g/g，低劑量含生藥量0.09 g/g。以上藥物均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)分子藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器

地塞米松磷酸鈉注射液, 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)寄生制藥有限公司, 國(guó)藥準(zhǔn)字 H41020036, 批號(hào)1801226；卵清蛋白(OVA，A5253-500G)購(gòu)自Sigma；氫氧化鋁干粉(S30353-500 g)購(gòu)自源葉生物。小鼠IGE ELISA試劑盒(貨號(hào)：m1037602)購(gòu)自酶聯(lián)生物；小鼠卵清蛋白特異性IGE酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號(hào):F2291-A)購(gòu)自凡科維；小鼠IL-4 ELISA試劑盒(貨號(hào)：m1002038)購(gòu)自酶聯(lián)生物；小鼠IFN-γ ELISA試劑盒(貨號(hào)：m002277)購(gòu)自酶聯(lián)生物；一抗Rabbit Anti-NGF(貨號(hào)：ABP51959)購(gòu)自Abbkine；一抗Rabbit Anti-TRKA(貨號(hào)：ABP55429)購(gòu)自Abbkine；中杉金橋PV-6000 通用二步法檢測(cè)試劑盒；DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

奧華402AI型超聲霧化儀(廣東魚(yú)躍)；離心機(jī)Eppendorf Centrifuge 5804 R；顯微鏡Olympus CX-41；數(shù)碼照相機(jī)SmartV350D；Hestion ATP 700(ST)電腦全自動(dòng)脫水機(jī)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek Instruments, Inc，型號(hào)Epoch)；自制塑料霧化箱(50×30 ×30)cm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)哮喘小鼠模型

根據(jù)對(duì)前人造模方法的研究和修改，建立經(jīng)由卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型。除正常對(duì)照組以外，其他各組小鼠分別在第0、7、14 天給予腹腔注射致敏液每只0.2 mL，致敏液成分為10 μg OVA和2 mg氫氧化鋁粉末；自21 d到28 d，給予5%OVA混懸液霧化吸入，每日一次，每次30 min，同時(shí)觀察小鼠呼吸運(yùn)動(dòng)情況，看是否有呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸、活動(dòng)減少等情況。正常對(duì)照組給予同體積的生理鹽水腹腔注射和霧化吸入[6]。

1.3.2 分組給藥治療

從第21 天開(kāi)始，霧化激發(fā)哮喘的同時(shí)，C組給予地塞米松注射液腹腔注射，每日一次，每只2 mg，D、E組分別給予高低濃度藥物貼敷治療，每日一次，每次4 h。A、B組不做給藥處理。

1.3.3 取材

在最后一次霧化吸入激發(fā)后24 h，收集全血，靜止2 h后，4℃，3000 r/min，離心10 min，取血清，-80℃低溫保存。取小鼠左肺，浸泡于4%甲醛溶液中，常溫保存。取小鼠右肺，生理鹽水沖洗掉血液后用濾紙吸干，放置-80℃低溫保存。

1.3.4 血清中總IGE、OVA特異性IGE、IFN-γ、IL-4的測(cè)定

血清于-80℃冰箱中取出，室溫融化。ELISA試劑盒于4℃冰箱中取出，室溫平衡20 min，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟逐個(gè)加樣，測(cè)定。

1.3.5 肺組織的病理改變(HE染色及Masson染色)

取甲醛固定24 h后的小鼠左肺，修剪后，流水沖洗10 min，石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，切片，烘片機(jī)38℃烘片0.5 h，溫箱68℃烘片2 h，二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。Masson染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.3.6 免疫組化檢測(cè)肺組織中NGF，TrKA蛋白的表達(dá)

石蠟包埋后切片，厚度0.6 μm，烘片機(jī)46℃烘片2 h，溫箱70℃烤片3 h，余溫過(guò)夜后二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原修復(fù)后，加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶16 min，洗凈后加10%胎牛血清0.5 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min，二抗孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入新鮮配置的DAB顯色劑，顯色3 min后，蒸餾水沖洗終止顯色，自來(lái)水中浸泡10 min，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化1 s，自來(lái)水浸泡10 min，梯度酒精、二甲苯脫水透明，中性樹(shù)膠封片后光鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理改變(HE染色和Masson染色)

正常對(duì)照組肺組織內(nèi)各級(jí)支氣管、肺泡壁、粘膜上皮形態(tài)較完整，偶見(jiàn)個(gè)別炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積；哮喘模型組可見(jiàn)支氣管粘膜及肺泡周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和藍(lán)色膠原纖維形成。部分肺泡破壞、融合，氣道上皮組織多處斷裂；地塞米松組、伏九貼高劑量組及伏九貼低劑量組較模型組相比，肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度以及膠原沉積數(shù)量均有所減輕，其中伏九貼高劑量組優(yōu)于伏九貼低劑量組，地塞米松組與伏九貼高劑量之間無(wú)明顯差異。(見(jiàn)圖1-2)

注：A：正常組小鼠肺組織；B：哮喘模型組小鼠肺組織；C：地塞米松組小鼠肺組織；D：伏九貼高劑量組小鼠肺組織；E：伏九貼低劑量組小鼠肺組織。圖1 小鼠肺組織的病理改變(HE染色)Note. Lung tissue of mice in (A) control group, (B) model group, (C) dexamethasone group, (D) high-dose Fujiu plaster group, and (E) low-dose Fujiu plaster group.Figure 1 Pathological changes of the mouse lung tissues. HE staining

2.2 ELISA檢測(cè)血清中總IGE、OVA特異性IGE、IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子含量

與正常對(duì)照組相比較，哮喘模型組小鼠血清中總IGE、OVA特異性IGE、IL-4濃度明顯升高，IFN-γ濃度明顯降低，均有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比較，地塞米松組和伏九貼高劑量組小鼠血清中總IGE、OVA特異性IGE、IL-4濃度降低，IFN-γ濃度升高，均有顯著差異(P<0.05)。與模型組比，伏九貼低劑量組小鼠血清中的IL-4濃度降低，差異顯著(P<0.05)，但總IGE、OVA特異性IGE和IFN-γ濃度改變不明顯，差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。(見(jiàn)表1)

2.3 免疫組化法檢測(cè)NGF和TrKA在肺組織內(nèi)的表達(dá)

如圖3所示，胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒為神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的陽(yáng)性表達(dá)，圖4中，胞漿內(nèi)棕黃色顆粒為T(mén)rKA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞數(shù)量以及胞漿中NGF和TrKA表達(dá)明顯增多；與模型組相比，地塞米松組和伏九貼高劑量組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而且NGF和TrKA蛋白的表達(dá)減少的也很明顯；伏九貼低劑量組與模型組相比，NGF和TrKA蛋白的表達(dá)棕黃色顆粒有所減少，但差異不明顯。(見(jiàn)表2)

注：與正常組比，*P<0.05;與模型組相比，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05.

注：A:正常對(duì)照組；B:模型組；C:地塞米松組；D:伏九貼高劑量組；E:伏九貼低劑量組。圖3 各組肺組織的病理改變Note. A， Normal control group. B， Asthma model group. C， Dexamethasone group. D， Fujiu plaster high dose group. E， Fujiu plaster low dose group.Figure 3 Histological changes in the lung tissues of the mice. NGF immunohistochemical staining

注：A：正常組；B：模型組；C：地塞米松組；D：伏九貼高劑量組；E：伏九貼低劑量組。圖4 各組小鼠肺組織中TrKA的表達(dá)(TrKA免疫組化染色)Note. A. Normal group. B. Model group. C. Dexamethasone group. D. Fujiu plaster high dose group. E. Fujiu plaster low dose group.Figure 4 TrKA expression in the lung tissues of the mice. TrKA immunohistochemical staining.

組別GroupsNGF (μm2) TrKA (μm2) 正常組Normal group模型組Model group地塞米松組Dexamethasone group伏九貼高劑量組Fujiu plaster high dose group伏九貼低劑量組Fujiu plaster low dose group209 882.23±25 401.53507 470.06±63 666.94?279 163.83±56 882.24△261 871.30±43 252.94△416 661.94±216 620.16165 186.90±42 661.72441 977.57±67 111.40?242 579.78±39 613.13△298 163.18±27 995.59△416 999.19±158 971.14

注：與正常組比，*P<0.05;與模型組相比，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05.

3 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘的發(fā)作是由于外感風(fēng)寒之邪誘發(fā)患者素體伏痰，導(dǎo)致肺失宣肅，痰氣搏結(jié)，壅阻氣道，因病之根本屬于本虛標(biāo)實(shí)，故治療原則為發(fā)作期以祛邪為主，緩解期以扶正為主。伏九貼膏中白芥子治皮里膜外、胸隔間之痰涎，甘遂善行逐水濕，元胡活血利肺氣，細(xì)辛生姜溫散而宣肺，麝香走竄，開(kāi)竅通閉，幫助藥物透皮吸收，結(jié)合穴位，調(diào)暢全身氣機(jī)，藥穴同用，祛邪同時(shí)扶正固本，長(zhǎng)期以來(lái)應(yīng)用于防治支氣管哮喘?，F(xiàn)有的關(guān)于穴位貼敷治療哮喘的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，應(yīng)用白芥子等藥物的穴位貼敷可逆轉(zhuǎn)卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠TH1/TH2失衡，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)[7-8]。但關(guān)于穴位貼敷是否是通過(guò)NGF/TrKA途徑來(lái)調(diào)節(jié)TH1/TH2失衡的研究，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究觀察了伏九貼膏穴位貼敷對(duì)哮喘小鼠肺組織NGF/TrKA的表達(dá)量以及對(duì)TH1/TH2失衡的影響，探討其抑制哮喘小鼠肺部炎癥的可能機(jī)制。

目前的研究認(rèn)為，在哮喘發(fā)病機(jī)制中TH1/TH2的失衡占有重要地位。其中，TH2型細(xì)胞因子分泌增多在哮喘的免疫失衡機(jī)制中具有關(guān)鍵作用[9]。IL-4作為T(mén)H2型細(xì)胞因子，可募集多種炎性因子，其中包括嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，從而加重炎癥反應(yīng)。并且通過(guò)促進(jìn)免疫球蛋白的轉(zhuǎn)換，使IGE 的分泌增多[10]。TH2型細(xì)胞因子增多的同時(shí)，抑制了TH1型細(xì)胞因子的分泌，IFN-γ屬于TH1型細(xì)胞因子，可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體等[11]。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)比觀察了小鼠生存狀態(tài)；肺組織切片HE染色和Masson染色的病理變化；ELASA分別檢測(cè)TH1型細(xì)胞因子IFN-γ和TH2型細(xì)胞因子IL-4、IGE以及OVA特異性IGE表達(dá)水平。結(jié)果顯示，卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠活動(dòng)明顯減少，呼吸頻率加快，并且呼吸時(shí)伴有點(diǎn)頭和喘鳴音，肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，并且細(xì)支氣管周圍可見(jiàn)膠原纖維的沉積，血清中IL-4、IGE、OVA特異性IGE表達(dá)顯著升高，IFN-γ表達(dá)降低，TH1/TH2失衡，說(shuō)明OVA誘導(dǎo)成功建立小鼠哮喘模型。相比于哮喘模型小鼠，經(jīng)伏九貼膏干預(yù)后，小鼠肺組織炎癥減輕，氣道膠原纖維減少，血清中IL-4、IGE、OVA特異性IGE表達(dá)降低，IFN-γ表達(dá)升高，說(shuō)明伏九貼膏通過(guò)降低TH2型細(xì)胞因子表達(dá)水平，升高TH1型細(xì)胞因子水平，使TH1/TH2趨于平衡，緩解哮喘相關(guān)癥狀。

近年來(lái)，關(guān)于神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)做為介導(dǎo)哮喘免疫源性炎癥的重要物質(zhì)受到人們的關(guān)注。NGF除了可由神經(jīng)細(xì)胞分泌外，還可由非神經(jīng)細(xì)胞(如免疫細(xì)胞、組織細(xì)胞等)分泌[12]。大量研究證實(shí)，哮喘小鼠肺組織內(nèi)存在NGF和TrKA的高表達(dá)[13,14]。酪氨酸激酶A(TrKA)做為NGF的高親和力受體，主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞中，尤其是在活化的CD4+T細(xì)胞[15]。在與NGF結(jié)合后，形成二聚體，經(jīng)磷酸化，發(fā)揮后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)[16]。歐陽(yáng)若云等[17]研究認(rèn)為，NGF通過(guò)上調(diào)TH2型細(xì)胞因子的表達(dá)，下調(diào)TH1型細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)并放大了TH1/TH2的免疫失衡，從而介導(dǎo)哮喘的免疫源性炎癥反應(yīng)。為了進(jìn)一步研究伏九貼膏調(diào)控TH1/TH2平衡的機(jī)制，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)伏九貼膏治療后的哮喘小鼠肺組織內(nèi)NGF和TrKA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，哮喘小鼠NGF和TrKA的表達(dá)量明顯升高，經(jīng)伏九貼膏治療后，NGF和TrKA的表達(dá)量均有不同程度的降低，說(shuō)明伏九貼膏可能是通過(guò)調(diào)控NGF/TrKA蛋白的表達(dá)使TH1/TH2趨于平衡從而緩解哮喘的發(fā)作。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，伏九貼膏通過(guò)下調(diào)NGF/TrKA蛋白的表達(dá)，促進(jìn)TH1型細(xì)胞因子的分泌，抑制TH2型細(xì)胞因子的釋放，使TH1/TH2趨于平衡，從而緩解了哮喘的發(fā)作。