應(yīng)用季節(jié)性流感病毒H3N2鼠適應(yīng)株建立小鼠模型

姜 靜，呂 琦，李楓棣，戚菲菲，王順意，王冠澎，徐艷峰，鮑琳琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021)

流感病毒(influenza virus)是引起人和動物傳染病流行最重要的病原體之一，目前已經(jīng)在世界上導(dǎo)致五次人群中的大規(guī)模流行。自1918年西班牙H1N1流感大流行后，1957年亞洲H2N2、1968年香港H3N2、1977年俄羅斯H1N1及2009年墨西哥H1N1流感大流行相繼出現(xiàn)，造成人力、物力等資源的巨大損失，其中僅在1968～1969 年香港H3N2流感大流行中就有約100 萬人被奪去了生命[1-3]。H3N2自1968年香港大流行以來，幾乎每年均以季節(jié)性流感的形式在我國頻繁出現(xiàn)[4-6]，是我國季節(jié)性流感的主要病毒株，已成為疫苗備選株的重要篩選對象。隨著H3N2亞型流感病毒在人群中不斷的進化、變異，預(yù)防流感或流感嚴(yán)重并發(fā)癥的疫苗至今也已更新三十余次[7-9]。與以往相比，近年來H3N2發(fā)生了較大變異，導(dǎo)致被感染人的數(shù)量顯著增多、癥狀明顯加重[10-13]，亟需開展研發(fā)相應(yīng)的治療藥物、疫苗等流感疫情應(yīng)對工作。

BALB/c小鼠是流感病毒致病性與疫苗研究常用的動物模型之一[14-16]。季節(jié)性流感病毒H3N2并不能直接感染小鼠，國際上大多采用建立鼠適應(yīng)株、反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建整合毒株的方式建立小鼠模型[17-23]，目前國內(nèi)還未建成H3N2流感病毒適應(yīng)株[24-25]。面對國內(nèi)目前不斷出現(xiàn)突變的H3N2流感病毒，新型疫苗株篩選、有效性評價急需H3N2動物模型。本文通過篩選合適的H3N2流感病毒株建立H3N2鼠適應(yīng)株，并應(yīng)用其建立小鼠模型，將為疫苗株篩選、疫苗和抗體有效性評價提供合適的研究工具，為季節(jié)性流感防控提供有力的實驗室支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF級雌性BALB/c小鼠60 只，4～6 周齡，體重13～15 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。所有的感染實驗均在動物生物安全二級實驗室(ABSL-2)中進行，所有操作經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所倫理委員會審核并批準(zhǔn)(BLL18004)。實驗動物的使用遵循3R原則。

季節(jié)性流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2)(WT)，由香港大學(xué)陳鴻霖教授惠贈。H3N2鼠適應(yīng)株(MA-7)由本實驗室在BALB/c小鼠體內(nèi)7 次適應(yīng)獲得。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

4～6 周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成2 組，每組30 只，設(shè)立WT組(對照組)和MA-7組(實驗組)，分別用A/Aichi/2/68(H3N2)WT和鼠適應(yīng)株(MA-7)滴鼻感染小鼠，感染劑量為每只106TCID50。在感染后第1、2、3、5、7和第9 天，每個時間點處死3 只小鼠，取肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管組織，用于病理檢查、病毒載量和病毒滴度的檢測。

1.2.2 病毒載量測定

提取組織的總RNA，進行探針法熒光定量PCR (Rea1-time PCR)檢測。上、下游引物序列為：InfA-Fwd 5’-GACCGATCCTGTCACCTCTGAC -3’，InfA-Rev 5’- AGGGCATTCTGGACAAAGCGTCTA -3’, InfA-Prb5’FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG -BHQ1-3’。Real-time PCR反應(yīng)條件為：50℃ 30 min；95℃ 15 min；94℃ 15 s，60℃ 45 s，35 個循環(huán)。

1.2.3 滴度測定

將組織勻漿接種于單層MDCK細(xì)胞中，37℃孵育1 h，PBS洗1遍，補充等體積的病毒培養(yǎng)液，72 h后收集細(xì)胞上清，加入火雞血進行復(fù)檢。利用Reed-Munch公式計算組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查

將小鼠的肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管組織進行標(biāo)本制備，制備方法采用甲醛固定、石蠟包埋、切片，H.E和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化使用NP單克隆抗體(1∶1000稀釋)，4℃過夜，PBS洗；加二抗(1∶1000稀釋)，室溫孵育，PBS洗； DAB顯色，蘇木素襯染后脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.5 基因組測序和比對

合成流感病毒8 個基因片段的PCR引物，對WT和MA-7的8 個基因片段進行高保真PCR擴增。PCR產(chǎn)物純化和測序后使用DNAStar軟件包進行序列拼接及比對。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)和死亡情況

WT組小鼠感染后，無明顯癥狀變化，14 d內(nèi)無小鼠死亡。MA-7組小鼠感染后，出現(xiàn)弓背、豎毛、活動遲緩、體型消瘦，第4天開始出現(xiàn)死亡，直至第9 天全部死亡。具體死亡情況見圖1。

2.2 小鼠體重變化

WT組小鼠感染后，小鼠體重持續(xù)上升，體重上升率最高可達(dá)14%。MA-7 組小鼠感染后第1天體重下降，一直持續(xù)至感染第9 天(小鼠全部死亡)逐漸下降，體重下降率峰值達(dá)到30%。小鼠感染后體重變化率見圖2。

圖1 鼠肺適應(yīng)株小鼠模型的死亡情況(n=10)Figure 1 The survival rate in the mice inoculated with WT and MA-7 virus

注：(a)圖中9組bar依次代表小鼠感染鼠肺適應(yīng)株(MA-7)后心、肺、氣管、脾、腎、腸、腦、眼、肝的病毒載量；(b) 圖中9組bar依次代表小鼠感染鼠肺適應(yīng)株(MA-7)后心、肺、氣管、脾、腎、腸、腦、眼、肝的病毒滴度。圖3 鼠肺適應(yīng)株小鼠模型各組織的病毒復(fù)制(n=3)Note. (a) The viral load in tissues of the mice infected with MA-7 virus. (b) The viral titer in tissues of the mice infected with MA-7 virus.Figure 3 Viral replication curves in tissues of the mice infected with MA-7 virus

圖2 鼠肺適應(yīng)株小鼠模型的體重變化(n=10)Figure 2 The loss of body weight in the mice inoculated with WT and MA-7 virus

2.3 病毒在各組織中復(fù)制動態(tài)變化

在小鼠感染后第1～9 天，檢測MA-7組小鼠的肺、心、肝、脾、腎、腸、腦等組織內(nèi)的病毒復(fù)制情況，用于明確病毒復(fù)制的組織器官，并監(jiān)測其復(fù)制動態(tài)變化，確定復(fù)制高峰期。結(jié)果顯示，肺、氣管、心、肝、腎均能檢測到病毒復(fù)制，其中以氣管和肺組織為主。MA-7組小鼠感染后，在第1～9 天均可在肺組織內(nèi)檢測到病毒復(fù)制，第2～5天為復(fù)制高峰期，最高可達(dá)到105.5TCID50。病毒在氣管中的復(fù)制能力低于肺組織，最高可達(dá)105.2TCID50，其可能與兩者的細(xì)胞表面受體分布特點相關(guān)。心、肝、脾、腎、腸、腦、眼組織均能檢測到病毒RNA，肝、腎組織在小鼠感染后第1～9 天間斷性地檢測到有病毒復(fù)制，其余組織均檢測不到。以上結(jié)果說明H3N2病毒復(fù)制只發(fā)生在呼吸系統(tǒng)中。具體結(jié)果如圖3所示。

2.4 小鼠模型的肺組織病理變化

MA-7組小鼠感染后可在肺、氣管、心、肝、腎組織內(nèi)可檢測到病毒復(fù)制，因此進一步比對病毒入侵的這些組織臟器中引起的病理改變。檢測結(jié)果顯示，氣管、心、肝、腎組織均無明顯的病理變化。肺組織HE結(jié)果顯示，在感染后第1～5 天內(nèi)，隨著感染天數(shù)增加，肺組織病變嚴(yán)重程度增大。在感染后第1天，局部肺泡間隔輕度增寬，少數(shù)支氣管上皮細(xì)胞變性壞死；在感染后第3天，肺泡間隔明顯增寬，支氣管上皮細(xì)胞變性壞死，肺泡內(nèi)可見少量炎細(xì)胞滲出，血管周圍水腫，少量出血；在感染后第5天，肺組織呈現(xiàn)病毒性間質(zhì)肺炎，肺泡間隔增寬程度增加，部分區(qū)域肺泡腔消失，炎細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)可見較多的炎細(xì)胞及漿液纖維素滲出，支氣管上皮細(xì)胞變性壞死，血管擴張充血；在感染后第7天，肺組織病變略有減輕。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在感染后第1～5 天內(nèi)，抗原顆粒隨著感染天數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢。

2.5 基因比對

測序分析結(jié)果顯示，MA-7 基因序列共檢出5 個突變位點，分別位于第 1891、550、1447、868 及 1192 位，其中2 個突變發(fā)生在 HA 蛋白中(P162Q、N483P)，3 個突變分別發(fā)生在 NA、PA、NP 蛋白中(V398I、 G631S、D290 N)， 引起氨基酸殘基序列改變。具體結(jié)果如表1所示。

3 討論

抗流感病毒的藥物、疫苗和抗體評價以及新發(fā)流感病毒的致病性方面的研究都需要合適的動物模型，流感動物模型是藥物轉(zhuǎn)化應(yīng)用的必不可少的技術(shù)支撐。而近年來H3N2流感病毒不斷變異產(chǎn)生新的毒株，疫苗保護效果不理想，需要不斷提供新的疫苗株，同時也需要更有效的抗病毒藥物；而H3N2流感病毒，野生毒株不能直接感染小鼠[24-26]，沒有合適的動物模型對于進行一些疫苗評價和藥物評價是一個巨大的問題。本研究是應(yīng)用H3N2流感病毒小鼠適應(yīng)株建立相應(yīng)的模型。前期曾應(yīng)用5株病人分離到的H3N2流感病毒建立小鼠適應(yīng)株，經(jīng)過20代左右適應(yīng)，但病毒不能在小鼠體內(nèi)復(fù)制。另外其他研究機構(gòu)[27]將H3N2流感病毒(A/Anhui/137/2008)在BALB/c小鼠體內(nèi)傳代40次，也未能構(gòu)建H3N2的適應(yīng)株。本次實驗應(yīng)用毒株A/Aichi/2/68(H3N2)，通過在BALB/c小鼠體內(nèi)多次適應(yīng)，期間通過不斷優(yōu)化組織的處理、病毒的富集方法，連續(xù)傳至7代后獲得敏感的鼠適應(yīng)株(MA-7)，并在此基礎(chǔ)上成功建立了小鼠模型。以上結(jié)果說明并不是所有H3N2流感病毒通過多次循環(huán)能夠獲得小鼠適應(yīng)性，并在小鼠體內(nèi)復(fù)制。本次構(gòu)建的H3N2適應(yīng)株小鼠模型可用于H3N2流感病毒發(fā)病機制及其相應(yīng)的藥物、疫苗、抗體評價等方面的研究。

MA-7(H3N2適應(yīng)株)可導(dǎo)致小鼠在感染后9天內(nèi)死亡，與野生毒株相比致病力顯著提升。實驗人員進行序列分析發(fā)現(xiàn)這種致病力的差異來自于病毒分子序列的改變。結(jié)果顯示，MA-7在HA、NA、PA、NP蛋白中出現(xiàn)了5個氨基酸突變，其中2個突變發(fā)生在HA蛋白中(P162Q、N483P)，3個突變分別發(fā)生在NA、PA、NP蛋白中(NA-V398I、 PA-G631S、NP-D290 N)，各位點的突變均未有報道。初步分析MA-7的基因多態(tài)性突變是致病力發(fā)生顯著性提升的分子基礎(chǔ)。上述突變位點的功能確認(rèn)還需通過反向遺傳學(xué)構(gòu)建相應(yīng)的突變毒株，逐個鑒定其功能。

注：上行顯示的是4周齡雌性BALB/c小鼠在感染鼠適應(yīng)株后肺組織HE(100倍)染色結(jié)果；下行顯示的是BALB/c小鼠在感染鼠適應(yīng)株后肺組織IHC(200倍)染色結(jié)果。圖4 流感病毒小鼠肺組織病理切片(HE，IHC)(n=3)Note. The upper line shows the results of the lung tissue HE staining of mice at 1,3,5 and 7 days after infection with MA-7 virus. The upper line shows the results of the lung tissue IHC staining of mice at 1,3,5 and 7 days after infection with MA-7 virus.Figure 4 Histological analysis of the lung tissues of the mice infected with MA-7 virus(HE,IHC staining)

病毒VirusPB2PB1PAHANPNAM2&M1NEP&NS1ntaantaantaantaantaa189163155016214474838682901192398WT--GGlyCProAAsnGAspGVal--MA-7--ASerAGlnGAspAAsnAlle--

注：WT： 野生株；MA-7： 鼠適應(yīng)株； nt, 堿基；aa, 氨基酸。

Note. WT, wild-type. MA-7, mouse-adapted. nt, nucleotide. aa, amino acid.

綜上所述，本次研究成功建立了季節(jié)性流感病毒H3N2適應(yīng)株小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)HA(P162Q、N483P)、NA(V398I)、PA(G631S)、NP(D290 N)5個氨基酸位點突變與其鼠適應(yīng)株的致病力增強相關(guān)，為進一步研究流感病毒鼠肺適應(yīng)的分子機理奠定了基礎(chǔ)。