小鼠、大鼠、食蟹猴與人的脂肪干細胞分離培養(yǎng)方法和生物學特性的比較分析

李珂雅，石桂英，高舒平，白 琳，秦 川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

干細胞治療為核心的再生醫(yī)學，在神經(jīng)、血液、心血管、生殖等系統(tǒng)和肝、腎、胰等器官的重大疾病治療方面發(fā)揮作用[1]。ADSCs具有來源充足、分離方法簡單、體外擴增能力強、能跨胚層分化等特性，可以通過抽脂術(shù)從皮下脂肪組織的血管周圍區(qū)域大量分離出來[2-5]，ADSCs相關(guān)的干細胞治療在過去的10年有了飛速的發(fā)展[1]。ADSCs表達包括CD10、CD13、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166和CD271在內(nèi)的間充質(zhì)干細胞的表面標記物，而造血干細胞特異性標記物CD34、血管內(nèi)皮細胞標記物CD31和成熟白細胞標記物CD45為陰性[6]。ADSCs是處于不同成熟和分化階段的異質(zhì)性細胞群，具有廣泛的可塑性和多向分化潛能[7-10]，在特定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，ADSCs能分化為肌上皮細胞[11]、心肌細胞[12]、成骨細胞[13]、軟骨細胞[14]、多巴胺能神經(jīng)元和乙酰膽堿能神經(jīng)元[6]等。此外，ADSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠分泌多種細胞因子以及抗凋亡、抗氧化、抗炎癥能力。

ADSCs在細胞替代治療中，有其獨特優(yōu)勢，它不引起倫理道德問題也不存在免疫排斥反應(yīng)及致瘤性，可用于自體治療[1]。目前，自體脂肪干細胞移植已經(jīng)用于多種疾病的治療以及改善預(yù)后，包括肌肉系統(tǒng)疾病[15]、肝切除術(shù)后的肝臟再生[16]、改善急性心梗的心肌灌注[17]，而這些疾病的治療目前仍處于臨床前實驗階段。本實驗通過從食蟹猴、C57小鼠及SD大鼠的皮下取得脂肪組織，進行分離培養(yǎng)鑒定，比較實驗動物的ADSCs與hADSCs在分離培養(yǎng)方法和生物學特性之間的差異，為自體脂肪干細胞移植的臨床前應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

人脂肪組織取自例女性臨床吸脂患者，平均年齡35歲，均于術(shù)前簽署知情同意書。小鼠脂肪組織來源于雌雄各半的6只SPF級6周齡C57小鼠，大鼠脂肪組織來源于雌雄各半的6只SPF級6～8周齡SD大鼠，食蟹猴脂肪組織來源于3只3～5周歲的雄性食蟹猴。本實驗用C57小鼠和SD大鼠從北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0009]購得。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2015-0035]。食蟹猴從北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責任公司[SCXK(京)2015-0011]購得。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北方資源中心普通環(huán)境[SYXK(京)2014-0036]。實驗方案通過中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批，IACUC號為：BL18004、BL17001、BL17002。實驗動物飼養(yǎng)繁育和實驗過程中，在不影響實驗要求和實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，嚴格按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM完全培養(yǎng)基(Gibco, 美國)；C57小鼠、SD大鼠、人、食蟹猴脂肪干細胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(Cyagen，美國)；青/鏈霉素混合液(Gibco，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；b-FGF(Novus，美國)；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；活細胞工作站(Leica，德國)；直熱式CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；25 cm2培養(yǎng)瓶、75 cm2培養(yǎng)瓶、6孔板、一次性移液管(Costar，美國)；生物安全柜(上海力康)；低速離心機(安徽中科中佳)；全自動細胞計數(shù)儀及配套細胞計數(shù)板(Invitrogen，美國)；流式細胞儀(BD，美國)；所用流式抗體見表1。

表1 流式細胞術(shù)所需抗體Table 1 The antibodies used in flowcytometer

1.3 實驗方法

1.3.1 人ADSCs體外分離培養(yǎng)

將人脂肪抽吸組織用無菌PBS沖洗3遍，洗去血液和麻醉藥，記錄剩余組織體積，以1∶2的比例加入0.075%的I型膠原蛋白酶，放入37℃恒溫搖床以80 r/min的速度消化30 min。加入與膠原酶等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以1500 r/min的速度離心11 min，棄上清，按1∶3的比例向細胞沉淀中加入紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫孵育5 min，加入PBS，經(jīng)過70 μm的細胞篩過濾至新的50 mL離心管，以1500 r/min的速度離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基重懸接種于T-25瓶，在培養(yǎng)瓶上標記細胞類型、代數(shù)、時間等，放入37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第二天更換新鮮培養(yǎng)基。以后每3 d換液1次。待細胞貼壁達80%后，以1∶2的比例傳代，完成脂肪干細胞的純化，取第3代(P3)細胞用于實驗。

1.3.2 小鼠、大鼠、食蟹猴ADSCs體外分離培養(yǎng)

脫頸處死小鼠或大鼠后備皮，采用高壓滅菌過的器械，于腹部做十字切口，皮下游離至腹股溝，取得皮下脂肪組織1～2 g。食蟹猴術(shù)前禁食不禁飲12 h，皮下給予硫酸阿托品0.1 mg/kg用于抑制腺體分泌，15 min后肌肉注射7 mg/kg的舒泰予以麻醉。進行備皮消毒鋪巾后，于臍下1 cm處腹中線的位置開長約2 cm的刀口，取得皮下脂肪組織1～2 g。放入已加入無菌PBS的50 mL離心管，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)間。將手術(shù)取得的脂肪在超凈臺中用PBS沖洗2遍，再用雙抗沖洗1遍，剪碎后分裝入50 mL離心管，以1∶2的比例加入0.075%的I型膠原蛋白酶，放入37℃恒溫搖床以80 r/min的速度消化1 h。后續(xù)步驟與人脂肪干細胞分離相同，取P3細胞用于實驗。

1.3.3 不同物種ADSCs分子表型的鑒定

分別取hADSCs、mADSCs、rADSCs、cADSCs第3代的細胞，PBS洗2次后培養(yǎng)瓶中加入0.25%Trpsin-0.04%EDTA，37℃下反應(yīng)5 min， 吸管反復(fù)吹打，鏡下確認細胞完全漂浮和分離，加入等量的細胞培養(yǎng)液中和胰蛋白酶，進行計數(shù)，將1×106的細胞分裝于1.5 mL離心管，離心后棄上清。各物種染色情況如表2：hADSCs和cADSCs分別每管加入40 μL PBS + 5 μL CD90(FITC)、5 μL CD29(PerCP-Cy5)、5 μL CD34(APC-Cy7)、5 μL CD31(PE-Cy7)人單克隆抗體，mADSCs每管加入40 μL PBS + 5 μL CD90(FITC)、5 μL CD29(PE)、5 μL CD45(PerCP-Cy5)、5 μL CD31(APC-Cy7)小鼠單克隆抗體，rADSCs每管加入40 μL PBS + 5 μL CD90(PE)、CD29(PE-Cy7)、CD34(APC)、CD31(BV421)大鼠單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗3次，1500 r/min離心5 min，20 μL PBS重懸，并用同型對照單克隆抗體確定背景標記后，流式細胞儀分析染色細胞，F(xiàn)lowJo軟件計算細胞表面抗原陽性表達率(單位用百分比表示)。

表2 不同物種ADSCs流式染色情況Table 2 The staining results of different species’ ADSCs

1.3.4 不同物種ADSCs分化能力比較

(一)不同物種ADSCs成脂分化

分別取P3 hADSCs和cADSCs、mADSCs、rADSCs，以3×105個細胞數(shù)接種于6孔板，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d半量換液，待細胞達到100%或者過匯合，小心吸走完全培養(yǎng)基，向6孔板中加入2 mL ADSCs成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液，誘導(dǎo)3 d后，吸走6孔板中的A液，加入2 mL ADSCs成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液，24 h后，吸走B液，換回A液進行誘導(dǎo)。

圖1 不同物種脂肪干細胞形態(tài)學(×10)Figure 1 Morphology of the hADSCs, cADSCs, mADSCs and rADSCs

誘導(dǎo)21 d，用1× PBS沖洗2次，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，固定30 min。吸走甲醛溶液，用1×PBS沖洗2次，每孔中加入1 mL油紅O染料工作液染色30 min，吸走油紅O染液，用1× PBS沖洗3次，于鏡下觀察成脂染色效果。

(二)不同物種ADSCs成骨分化

分別取P3 hADSCs、mADSCs、rADSCs和cADSCs，以3×105個細胞數(shù)接種于提前包被0.1%明膠的6孔板中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d半量換液，當細胞匯合度達到60%～70%時，小心將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向6孔板中加入2 mL脂肪干細胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，每隔3 d換用新鮮成骨培養(yǎng)基。

誘導(dǎo)28 d，用1× PBS沖洗2次，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，固定30 min。吸走甲醛溶液，用1×PBS沖洗2次，每孔加入茜素紅染色5 min。吸走茜素紅染液，用1× PBS沖洗3次，于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

2 結(jié)果

2.1 常用實驗動物ADSCs和hADSCs的形態(tài)學觀察比較

ADSCs分離培養(yǎng)8 h后開始有少量細胞貼壁生長，24 h后可見多量細胞貼壁，細胞貼壁初期，形態(tài)為小圓形，隨著培養(yǎng)時間的增加，逐漸呈梭形。24 h后第一次換液，以后每3 d換液一次，培養(yǎng)3～4 d時，細胞生長繁殖，數(shù)量增加，并可見細胞形成孤立小片(細胞島)。7～10 d細胞已基本鋪滿瓶壁形成致密單層。不同物種原代細胞起初形態(tài)不均一，有多角形、短梭形、長梭形等，經(jīng)傳代純化后的hADSCs和cADSCs形態(tài)是成纖維細胞樣，mADSCs和rADSCs胞體較hADSCs更為短小，呈紡錘形(圖1)。

2.2 常用實驗動物ADSCs與hADSCs的細胞表面標記物檢測

為了進一步驗證從各物種取得的脂肪組織中分離培養(yǎng)得到的細胞，采用流式細胞術(shù)檢測P3細胞分子標記(圖2)。hADSCs和常用實驗動物ADSCs均表達間充質(zhì)干細胞表面標記物CD90、CD29，hADSCs、cADSCs和rADSCs少量表達造血干細胞表面標記物CD34，幾乎不表達血管標記物CD31，mADSCs少量表達 CD34、CD31。各物種ADSCs表面分子標記物的流式檢測結(jié)果見表3。

注：A：流式細胞術(shù)檢測ADSCs 表面標記物CD90；B：流式細胞術(shù)檢測ADSCs 表面標記物CD29；C：流式細胞術(shù)檢測ADSCs 表面標記物CD31；D：流式細胞術(shù)檢測ADSCs 表面標記物CD34。圖2 ADSCs流式細胞術(shù)鑒定Note. A，The flow cytometric analysis of CD90. B，The flow cytometric analysis of CD29. C，The flow cytometric analysis of CD31. D，The flow cytometric analysis of CD34.Figure 2 Flow cytometric analysis of the hADSCs, mADSCs, rADSCs and cADSCs

細胞類別ADSCs from different species陽性表面標記物Positive markers of ADSCs陰性表面標記物Negative markers of ADSCsCD90(%)CD29(%)CD34(%)CD31(%)hADSCs88.61±7.6583.55±10.9526.65±7.251.53±0.93cADSCs87.40±9.4093.75±3.7535.05±6.550.53±0.33mADSCs75.45±4.3595.50±4.4018.10±3.4016.20±5.40rADSCs87.35±8.0582.70±1.7029.85±11.750.67±0.43

2.3 常用實驗動物ADSCs與hADSCs成脂分化能力比較

不同物種的ADSCs均顯示出成脂分化潛能，但在誘導(dǎo)時間和成脂成骨能力上存在差異。mADSCs成脂誘導(dǎo)分化7 d后，即有大量小而圓脂滴形成，rADSCs在成脂誘導(dǎo)分化14 d時能產(chǎn)生脂滴， cADSCs在誘導(dǎo)分化14 d時有脂滴形成，但零散分布且不飽滿，延長誘導(dǎo)分化時間至21 d有多量脂滴形成，hADSCs所需誘導(dǎo)時間最長，21 d產(chǎn)生脂滴，被油紅O染成紅色(圖3)。

注：上行顯示的是hADSCs、cADSCs、mADSCs和rADSCs未成脂誘導(dǎo)分化的油紅O染色結(jié)果，下行顯示的是對應(yīng)物種ADSCs成脂分化的油紅O染色結(jié)果。圖3 不同物種脂肪干細胞成脂分化(油紅O染色，×10)Note.The upper line shows the results of the oil red O staining of hADSCs, cADSCs, mADSCs and rADSCs which are uninduced adipogenic differentiation. The next line shows the results of the oil red O staining of hADSCs, cADSCs, mADSCs and rADSCs after adipogenic differentiation.Figure 3 Adipogenic differentiation of the hADSCs, cADSCs, mADSCs and rADSCs(Oil red O staining)

2.4 常用實驗動物ADSCs與hADSCs成骨分化能力比較

成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d，各物種ADSCs均能明顯成骨。如圖4所示， hADSCs有大量片狀鈣鹽沉積，鈣鹽相互融合，幾乎未見空隙，cADSCs、mADSCs和rADSCs成骨誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生鈣鹽，被茜素紅著色。

3 討論

ADSCs于2001年首次分離鑒定獲得，經(jīng)過廣泛研究發(fā)現(xiàn)，它具有間充質(zhì)干細胞的特性，在再生醫(yī)學方面頗具使用價值[18]?，F(xiàn)如今，ADSCs的應(yīng)用并不局限于基礎(chǔ)科學，它具有免疫調(diào)節(jié)作用，能分泌各種生長因子，同時具有抗凋亡和抗炎癥的潛能[1]。其儲量豐富，可體外培養(yǎng)分化為多種細胞類型，再植入患者體內(nèi)進行治療。由于ADSCs具備這些特性，人們試圖尋求基于ADSCs的有效方法用于治療各類疾病，如糖尿病足潰瘍、多發(fā)性硬化癥、骨關(guān)節(jié)炎、危重肢體缺血、神經(jīng)退行性疾病等。目前除少量自體脂肪干細胞治療疾病有臨床前期試驗的報道，其余關(guān)于自體脂肪干細胞治療的研究仍處于臨床前階段[19]。

ADSCs以往的研究表明，皮下脂肪來源的ADSCs在增殖和分化能力方面均強于內(nèi)臟脂肪來源的ADSCs[20-22]，年輕人的ADSCs產(chǎn)量、增殖速度和分化能力均優(yōu)于老年人[23]，且隨著年齡的增長，ADSCs的衰老基因表達增加，負責調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡和分化的miRNA表達量和細胞維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的能力降低[24]。

本研究中，mADSCs和rADSC的制備方法與hADSCs的制備方法相同，在相同條件下培養(yǎng)，具有相同的生物學特性：從年輕實驗動物的皮下分離出的脂肪組織采用組織剪碎和膠原酶消化的方法，于37℃條件下消化1 h，由吸脂術(shù)獲得的人脂肪組織膠原酶消化30 min后，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d，獲得形態(tài)呈梭形的ADSCs。鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)mADSCs和rADSCs胞體較hADSCs和cADSCs的成纖維細胞樣更為短小，呈紡錘形；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示各物種ADSCs表面標記物比例基本一致，其中rADSCs的表面標記物比例與hADSCs最為相似；各物種的ADSCs均具有成脂成骨分化潛能。在成脂誘導(dǎo)過程中，mADSCs成脂時間最短，7 d即能產(chǎn)生脂滴，而hADSCs成脂時間相對較長。結(jié)果歸納如表4。

但各物種ADSCs在表型和功能上仍存在一些差異，可能與其表達的蛋白有關(guān)。Nahar[25]采用液質(zhì)聯(lián)用的方法檢測mADSCs和hADSCs蛋白表達并進行GO(Gene Ontology)分析，92%的蛋白類型一致，另8%的蛋白差異存在于細胞粘附相關(guān)表面蛋白上。故本實驗中hADSCs、mADSCs表現(xiàn)不同可能與細胞粘附相關(guān)蛋白表達差異有關(guān)。

利用包括小鼠、大鼠、食蟹猴在內(nèi)的實驗動物進行基礎(chǔ)研究詳細闡明ADSCs的特性和功能對確認ADSCs治療人類疾病的安全性和有效性具有極其重要的研究意義。因此，本實驗將實驗動物ADSCs與hADSCs進行比較分析，結(jié)果表明，實驗動物來源的ADSCs與hADSCs特性基本一致，可以很好得替代hADSCs進行自體脂肪干細胞移植的臨床前有效性和安全性評價。

注：上行顯示的是hADSCs、cADSCs、mADSCs和rADSCs未成骨誘導(dǎo)分化的茜素紅染色結(jié)果，下行顯示的是對應(yīng)物種ADSCs成骨分化的茜素紅染色結(jié)果。圖4 不同物種脂肪干細胞成骨分化(茜素紅染色，×10)Note. The upper line shows the results of the alizarin red S staining of the hADSCs, cADSCs, mADSCs and rADSCs which are uninduced osteogenic differentiation. The next line shows the results of alizarin red S staining of hADSCs, cADSCs, mADSCs and rADSCs after osteogenic differentiation.Figure 4 The osteogenic differentiation of the hADSCs, cADSCs, mADSCs and rADSCs.(Alizarin Red S staining)

細胞類別Cell type 形態(tài)學Morphology細胞表面標記Markers of ADSCs成脂時間Time of adipogenic differentiation成骨時間Time of osteogenic differentiationhADSCs長,梭形Long spindleCD29+/CD90+/CD31-21 d21 dcADSCs長,梭形Long spindleCD29+/CD90+/CD31-14 d(少量)A little in 14 d21 dmADSCs短,紡錘形Short spindleCD29+/CD90+/CD31-7 d21 drADSCs短,紡錘形Short spindleCD29+/CD90+/CD31-14 d(多量)A large number of lipid drops in 14 d21 d