美金剛通過調(diào)節(jié)ERK、CREB信號通路及突觸可塑性保護(hù)腦缺血再灌注小鼠的作用研究

宋加興，張清秀，何 磊，魏秀娥*

(1．徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004；2．徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 221006)

缺血性腦卒中作為主要的腦血病事件，其危害主要表現(xiàn)為致死率、致殘率高，患者預(yù)后較差，給家庭和社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)[1]。盡管對于缺血性腦卒中有大量的研究，但目前有效的治療手段仍較為局限。NMDA受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor)即N-甲基-D-天冬氨酸受體，是離子型谷氨酸受體的一個(gè)亞型，對神經(jīng)元及神經(jīng)元的軸突和樹突的結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用，并且參與了突觸可塑性形成[2]。研究表明，在發(fā)生缺血性卒中后，細(xì)胞外谷氨酸的大量上升，使細(xì)胞外的NMDA受體過度刺激，引起興奮性氨基酸毒性，使腦組織神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元可塑性發(fā)生改變[3]。美金剛作為一種非競爭性，低親和力的NMDA受體拮抗劑，目前在臨床上主要應(yīng)用于阿爾茨海默病的治療。López-Valdés等人[4]實(shí)驗(yàn)顯示，在缺血性卒中發(fā)生后給予美金剛藥物時(shí)，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷募毙匀毖X損傷可以減輕。這可能與抑制興奮性氨基酸毒性作用有關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)給藥時(shí)間主要在缺血前預(yù)處理給藥，或者急性期缺血后短時(shí)間內(nèi)給藥，主要關(guān)注的時(shí)間點(diǎn)均為腦缺血急性期的變化。目前尚不清楚在腦缺血急性期后的恢復(fù)期給予美金剛,對缺血損傷的作用和相關(guān)機(jī)制。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和其下游的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)，是NMDA受體下游信號通路分子，參與細(xì)胞編碼相關(guān)基因和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)在小鼠腦缺血后24 h后給予美金剛干預(yù)，研究美金剛對于腦缺血急性期后恢復(fù)期的相關(guān)作用和可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級8～10周齡C57/BL6J雄性小鼠60只，體重23～26 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[SCXK(魯) 2014-0007]。動(dòng)物飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)[SYXK(蘇)2016-0028]，溫度25℃，相對濕度50%，維持正常晝夜節(jié)律。動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(IACUC：2018051803)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在使用中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

甲酚紫染料(美國Solarbio公司)，MCAO硅膠線栓(中國廣州佳靈生物技術(shù)有限公司，型號1800/1900)，美金剛試劑(中國MedChemExpress有限公司)，戊巴比妥鈉試劑(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)，OCT冰凍切片包埋劑(美國Sakura公司)，其中兔抗多克隆ERK、p-ERK抗體和兔抗多克隆CREB、p-CREB抗體(美國CST公司)，兔抗多克隆PSD-95和Synaptophysin抗體(中國Proteintech公司)，兔二抗及ECL發(fā)光液(中國碧云天公司)。

冰凍切片機(jī)(萊卡CM1950)，光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX43)，體視顯微鏡(中國Motic公司)，Western Blot相關(guān)設(shè)備(美國Bio-Rad公司)，動(dòng)物行為學(xué)設(shè)備(中國瑞沃德有限公司)，動(dòng)物行為學(xué)分析軟件(美國Harvard Apparatus公司)，小鼠激光多普勒血流儀(中國武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與給藥

按照隨機(jī)數(shù)字法將60只C57/BL6J雄性小鼠隨機(jī)分組為假手術(shù)組(Sham)、模型組(MCAO)、美金剛20 mg/kg組(M20)、美金剛4 mg/kg組(M4)及生理鹽水組(NS)，每組12只。美金剛藥物濃度參考Culmsee 等人實(shí)驗(yàn)[6-7]。給藥方式為腹腔注射，首次給藥時(shí)間點(diǎn)在缺血再灌注24 h后給藥，其后每天固定時(shí)間點(diǎn)腹腔給藥1次，持續(xù)給藥4周。

1.3.2 小鼠腦缺血再灌注模型

2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，仰臥位固定行頸部正中切口，使用血管鑷鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分支，使用7-0縫合線在頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈處打活結(jié)備用，并用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，用血管剪在頸外動(dòng)脈處剪一小缺口，將硅膠線栓自頸外動(dòng)脈缺口處插入，此時(shí)松開動(dòng)脈夾，線栓順勢緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)線栓插入深度距頸動(dòng)脈分叉處8.5 mm左右感到輕微阻力時(shí)停止進(jìn)栓，并用預(yù)留縫合線固定線栓，將小鼠放入37℃恒溫箱中保溫，缺血60 min后，拔出線栓，結(jié)扎血管，縫合皮膚，放入恒溫箱中直至小鼠完全蘇醒，放入飼養(yǎng)箱中。假手術(shù)組僅鈍性分離各個(gè)血管。為了保證造模成功率，在手術(shù)前，術(shù)中和復(fù)灌后使用激光多普勒血流測量法測量局部腦血流量。術(shù)中腦血流下降至基線80%以下，復(fù)灌后腦血流上升至80%以上為造模成功。復(fù)灌后模型組小鼠死亡2只，美金剛20 mg/kg組(M20)死亡3只、美金剛4 mg/kg組(M4)死亡3只及生理鹽水組(NS)死亡3只，后續(xù)補(bǔ)充造模至每組12只樣本。

1.3.3 小鼠腦萎縮體積測定

參考Cai等人[8]方法，腦組織冰凍切片，每隔0.4 mm一片腦片貼于載玻片上(前囟1.3～-2.7 mm之間)，將貼好的玻片放入濃度0.1%的甲酚紫溶液中15 min，放入去離子水中1 h后晾干，顯微鏡下拍照，用Image J軟件計(jì)算小鼠腦萎縮體積，將腦片正常側(cè)面積減去梗死側(cè)的面積，即萎縮面積，腦萎縮體積計(jì)算公式為V=1/3×h×(S1+S2+√S1×√S2)，其中h為相鄰兩片腦片的間隔，此處h為0.4 mm。

1.3.4 小鼠體重變化

術(shù)前及術(shù)后1～5周時(shí)間點(diǎn)稱量小鼠體重，并與術(shù)前體重進(jìn)行比較。體重變化=術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)體重—術(shù)前體重，記錄相應(yīng)數(shù)值。操作采用單盲方法，即評估者對動(dòng)物分組不知情。

1.3.5 改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)

參考Choi等人[9]方法，在術(shù)前及術(shù)后的1～5周時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評估內(nèi)容包括小鼠的運(yùn)動(dòng)，反射與平衡功能，評分結(jié)果在0～14分之間，分?jǐn)?shù)越高，則表明動(dòng)物損傷越嚴(yán)重。操作采用單盲方法，即評估者對動(dòng)物分組不知情。

1.3.6 粘附物去除實(shí)驗(yàn)(Adhesive removal test)

參考Ma等人[10]方法，用粘附物去除實(shí)驗(yàn)評估動(dòng)物的感覺和運(yùn)動(dòng)功能變化。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠左前爪無毛區(qū)域覆蓋一3 mm×4 mm大小的膠帶，每只小鼠粘貼的力度和方式應(yīng)保持一致。貼完后將小鼠放入飼養(yǎng)籠中，觀察并記錄小鼠接觸膠帶和撕去膠帶的時(shí)間，觀察時(shí)長為120 s，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取結(jié)果的平均值。在小鼠手術(shù)前，應(yīng)提前每天訓(xùn)練1次，持續(xù)3 d，然后在手術(shù)后的1～5周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。接觸的定義為小鼠爪子出現(xiàn)搖晃或用嘴觸碰膠帶。

1.3.7 小鼠Morris水迷宮試驗(yàn)(Morris water maze)

在術(shù)后的第5周時(shí)，提前將小鼠轉(zhuǎn)移至水迷宮房間適應(yīng)環(huán)境，水迷宮水池直徑121 cm，深度為45 cm，直徑10 cm的平臺在水下深度為1 cm，池水溫度保持在21℃～22℃之間。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：每只小鼠每天訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練4 d。第1天訓(xùn)練時(shí)，將小鼠面向池壁沿水面放入水池中，4個(gè)象限各放入一次，開始記錄小鼠找到隱藏在水下平臺的時(shí)間，即逃避潛伏期；如果60 s內(nèi)小鼠未找到平臺，則將小鼠引導(dǎo)至平臺，并使其在平臺停留10 s學(xué)習(xí)記憶平臺所在位置，結(jié)束后將小鼠移走，進(jìn)行下一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。第2～4天的操作過程同第1天。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：在第5天時(shí)，撤掉位于水下的平臺，將小鼠面朝池壁，從平臺所在對側(cè)象限放入水中，行為學(xué)軟件記錄1 min內(nèi)小鼠在平臺所在象限時(shí)間，穿臺次數(shù)和空間探索實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行一次。

1.3.8 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

每組取4只樣本，術(shù)后5周時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，提取缺血側(cè)腦組織勻漿后，加入細(xì)胞裂解液，蛋白溶解酶抑制劑裂解，置于4℃離心機(jī)12 000 r/min，離心10 min，移取上清液獲取蛋白。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性、上樣、進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)。一抗孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1～2 h，配制ECL發(fā)光液發(fā)光、顯影，然后用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 美金剛對腦缺血小鼠體重與神經(jīng)功能評分的影響

術(shù)后小鼠體重變化結(jié)果提示，在第4～5周時(shí)，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)的小鼠體重明顯增加，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后小鼠神經(jīng)功能缺損評分提示，在第3～5周時(shí)，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)小鼠神經(jīng)功能缺損程度明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見圖1)

2.2 美金剛對腦缺血小鼠腦萎縮體積的影響

腦組織冰凍切片甲酚紫染色結(jié)果提示，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)小鼠腦萎縮體積較其他組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見圖2)

2.3 美金剛對腦缺血小鼠粘附物去除實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

術(shù)后小鼠粘附物去除實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在第3～5周時(shí)，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)小鼠開始接觸膠帶與去除膠帶的時(shí)間均出現(xiàn)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見圖3)

2.4 美金剛對于腦缺血小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

術(shù)后第5周開始進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在實(shí)驗(yàn)開始的第2～4天，美金剛20 mg/kg組小鼠可以更快的找到隱藏在水下的平臺，表現(xiàn)為平臺潛伏期明顯下降，與其他三組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；定位航行實(shí)驗(yàn)中：美金剛20 mg/kg組小鼠穿臺次數(shù)較其他三組明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；美金剛20 mg/kg組小鼠在平臺所在象限停留時(shí)間明顯多于其他三組小鼠停留時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在第5天的定位航向?qū)嶒?yàn)中，各組小鼠的游泳速度表明各組小鼠游泳能力無差異(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見圖4)

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖1 小鼠體重變化和小鼠mNSS評分變化(n=12)Note. M20 group compared with MCAO group ，*P<0.05.M20 group compared with M4 group ，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 1 Changes in body weight and mNSS scores in the mice

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比， #P<0.01；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖2 小鼠腦缺血后腦萎縮體積變化(甲酚紫染色)(n=8)Note.M20 group compared with MCAO group ，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 2 Changes of brain atrophy volume after cerebral ischemia in the mice (cresyl violet staining)

2.5 美金剛對于腦缺血小鼠缺血腦組織中ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白的影響

分別以p-ERK1/2/ ERK1/2、p-CREB/ CREB的比值作為ERK1/2與CREB活化表達(dá)的衡量標(biāo)準(zhǔn)，與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)的磷酸化的ERK1/2、CREB的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見圖5)

2.6 美金剛對于腦缺血小鼠缺血腦組織中PSD-95，synaptophysin蛋白的影響

與模型組(MCAO)、美金剛4 mg/kg組(M4)和生理鹽水組(NS)相比，美金剛20 mg/kg組(M20)的PSD-95，synaptophysin蛋白的表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見圖6)

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖3 小鼠粘附物去除實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(n=12)Note. M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 3 Results of mouse adhesive removal test

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖4 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(n=12)Note.M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 compared with NS group，&P<0.05.Figure 4 Results of mouse Morris water maze test

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖5 小鼠腦組織ERK1/2與CREB蛋白含量比較(n=4)Note. M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 5 ERK1/21/2 and CREB protein contents in the mouse brain tissue

注：美金剛20 mg/kg組(M20)與模型組(MCAO)相比，*P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與美金剛4 mg/kg組(M4)相比，#P<0.05；美金剛20 mg/kg組(M20)與生理鹽水組(NS)相比，&P<0.05。圖6 各組小鼠腦組織PSD-95與synaptophysin蛋白含量比較(n=4)Note.M20 group compared with MCAO group，*P<0.05.M20 group compared with M4 group，#P<0.05.M20 group compared with NS group，&P<0.05.Figure 6 PSD-95 and synaptophysin protein contents in brain tissue of the mice

3 討論

缺血性卒中起病急，治療時(shí)間窗窄。在腦缺血急性期后，如何最大程度的保護(hù)缺血半暗帶神經(jīng)元的存活，提高神經(jīng)元的可塑性，是目前眾多基礎(chǔ)研究的方向。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法構(gòu)建小鼠局灶性腦缺血再灌注模型，較好的模擬了人類腦缺血發(fā)病后靜脈溶栓或介入取栓后，腦缺血再灌注損傷的發(fā)病過程和損傷機(jī)制。

腦缺血再灌注損傷后，突觸后膜NMDA 受體激活，鈣離子通道開放，細(xì)胞外的鈣離子大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起興奮性氨基酸毒性損傷[11]。美金剛作為NMDA受體拮抗劑，可以干預(yù)興奮性氨基酸毒性引起的腦缺血再灌注損傷。小鼠腦缺血急性期給予美金剛預(yù)處理，可以減輕腦組織的梗死體積和神經(jīng)元損傷，減輕細(xì)胞凋亡，減輕血管神經(jīng)單元的損傷[12]。既往Wang等[7]研究表明，小鼠腦缺血后持續(xù)皮下給予美金剛，小鼠的運(yùn)動(dòng)功能損傷改善，小鼠腦組織紋狀體萎縮體積下降，腦源性神經(jīng)生長因子及血管生長因子表達(dá)增加。小鼠腦缺血后美金剛口服治療，小鼠7 d內(nèi)行為學(xué)結(jié)果及腦梗死體積未出現(xiàn)明顯改善；但在持續(xù)給予美金剛28 d后，小鼠轉(zhuǎn)筒實(shí)驗(yàn)及網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果出現(xiàn)改善，腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生減少，新生血管密度增加[4]。

ERK1/2與CREB是NMDA受體下游信號通路的蛋白分子，ERK1/2在細(xì)胞的生長、分化中發(fā)揮作用；下游的CREB參與認(rèn)知學(xué)習(xí)及長時(shí)程記憶，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與神經(jīng)元的生長、發(fā)育相關(guān)。其中ERK1/2、CREB蛋白的生物活性與其磷酸化水平是相關(guān)的。腦缺血損傷時(shí)，由于興奮性氨基酸的毒性作用，組織與細(xì)胞損傷加重，ERK1/2活性受到抑制，其下游的CREB活性受到抑制，另外其下游的Bcl-2及BDNF的活性也受到影響，認(rèn)知學(xué)習(xí)功能受損[13]。小鼠腦缺血損傷后，腦組織中ERK1/2和CREB活性受到抑制，磷酸化表達(dá)水平明顯下降；當(dāng)缺血組織中ERK1/2被激活后，可以抑制鈣離子內(nèi)流，抑制NMDA活性，下游的CREB激活，從而減輕興奮性氨基酸毒性造成的神經(jīng)元損傷，減輕了動(dòng)物的認(rèn)知記憶功能，改善了突觸可塑性[14-15]。本研究顯示，美金剛20 mg/kg組干預(yù)后，小鼠的缺血側(cè)腦組織中p-ERK1/2及p-CREB蛋白表達(dá)明顯升高，而總的ERK1/2及CREB 蛋白含量無明顯變化，小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)提示缺血小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能損傷明顯改善。

突觸后致密物-95(postsynaptic density-95，PSD-95)是位于突觸后膜的一種腳手架蛋白。突觸素(synaptophysin)是一種突觸囊泡部位鈣結(jié)合蛋白。正常情況下，PSD-95與突觸素，在突觸連接的生成及維持中，在NMDA受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用；兩者與腦組織的突觸可塑性及學(xué)習(xí)認(rèn)知功能關(guān)系密切[16-17]。腦缺血損傷時(shí)，缺血側(cè)腦組織的PSD-95及synaptophysin蛋白表達(dá)明顯下降，而腦缺血損傷得到抑制時(shí)，PSD-95及synaptophysin表達(dá)上調(diào)[18-19]。本研究顯示，腦缺血美金剛20 mg/kg組干預(yù)后，缺血側(cè)腦組織的PSD-95、synaptophysin的蛋白表達(dá)明顯上升，改善了腦缺血小鼠的突觸可塑性及學(xué)習(xí)認(rèn)知功能。

綜上，腦缺血再灌注后持續(xù)美金剛治療，可以促進(jìn)小鼠的神經(jīng)功能損傷的恢復(fù)，改善小鼠的認(rèn)知記憶功能，改善腦組織的突觸可塑性表達(dá)。這種延遲的神經(jīng)保護(hù)作用，可能與美金剛激活ERK、CREB信號通路和上調(diào)PSD-95及synaptophysin蛋白的表達(dá)有關(guān)。這為臨床中缺血后卒中病人認(rèn)知功能障礙的預(yù)后治療，提供了新的思路。