UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測小花鬼針草中6種單體成分的含量

吳丹，王靜，黃碧云，王艷，劉龍*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州 511436;2.天津佰肽特醫(yī)藥科技有限公司， 天津 300000;3.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

小花鬼針草(BidensparvifloraWilld. ) 為菊科(Compositae)鬼針草屬 (BidensL.)植物，全草入藥，具有清熱、解毒、抗氧化、抗瘧疾等功效[1-2]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道從鬼針草屬植物中分離的化學(xué)成分主要有黃酮類、酚酸類、多炔類、揮發(fā)油等[3-4]，其中黃酮類具有有活血化淤 、降壓通脈的功效，對動(dòng)脈粥樣硬化、血管栓塞疾病有預(yù)防和治療作用[5-6]；酚酸類成分具有止血、抗菌等功效[7]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的對小花鬼針草中黃酮類成分的含量檢測多采用紫外分光光度法[8]、高效液相色譜法[7, 9-10]、高效毛細(xì)管電泳法[11]等方法，這些方法雖能夠?qū)崿F(xiàn)對成分的含量測定，但存在有一定的缺陷，比如分析時(shí)間較長、方法靈敏度較低等。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)是近幾年來新興的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，與常規(guī)液相色譜相比分析速度更快、分離度及靈敏度更高，已廣泛應(yīng)用于血藥濃度檢測，以及中草藥、中成藥、化學(xué)藥物有效成分與雜質(zhì)的檢測[12-15]。本文參照相關(guān)文獻(xiàn)中小花鬼針草黃酮類成分的檢測方法，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)檢測小花鬼針草中6種單體成分原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、和山奈酚的方法，該方法分析時(shí)間短、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，能夠?yàn)樾』ü磲槻莸馁|(zhì)量控制提供有效的參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Agilent 1290/6460，配有ESI源，Mass Hunter 工作站)；移液器(德國Eppendorf Research Plus系列)；電子分析天平(瑞士Metter Toledo ME155DU)；超純水器(美國Thermo Fisher GenPure Pro Standard)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司KQ-118)。

對照品原兒茶酸(批號(hào)110809-201205)、蘆丁(批號(hào)100080-201610)、槲皮苷(批號(hào)111538-200302)、槲皮素(批號(hào)100081-200907)、山奈酚(批號(hào)110861-201611)、芍藥苷(批號(hào)110736-201640，作為內(nèi)標(biāo)物)均購自中國食品藥品檢定研究院；金絲桃苷(批號(hào)G1411047)購自阿拉丁試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于等于98%。藥材小花鬼針草于2017年采自廣州新造鎮(zhèn)，由本校生藥學(xué)教研室鑒定為小花鬼針草的干燥全草。乙腈、甲醇均為色譜純；甲酸為質(zhì)譜級；水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent SB C18色譜柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序?yàn)椋?～4 min，30%乙腈；4～5 min，30～80%乙腈；5～10 min，80%乙腈。流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，柱溫為35 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：多反應(yīng)檢測(MRM)模式，負(fù)離子檢測；其他質(zhì)譜條件：源噴射電壓4000 V，離子源溫度300 ℃，干燥氣流量11.0 L/min，霧化器壓力103.4 kPa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 小花鬼針草中6種單體成分及內(nèi)標(biāo)物的主要質(zhì)譜參數(shù)

2.3 混合對照品溶液的制備

2.3.1 混合對照品儲(chǔ)備液的配制

分別精密稱取原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素和山奈酚對照品至容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成對照品儲(chǔ)備液。精密移取各對照品儲(chǔ)備液至10 mL量瓶中，用甲醇定容得混合對照品儲(chǔ)備液，各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為原兒茶酸25.13 μg/mL、蘆丁29.89 μg/mL、金絲桃苷27.50 μg/mL、槲皮苷13.06 μg/mL、槲皮素12.75 μg/mL和山奈酚24.25 μg/mL。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制

精密稱取芍藥苷對照品至容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為210 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.3.3 混合對照品溶液的配制

分別精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液10 μL，混合對照品儲(chǔ)備液適量，移至1.5 mL離心管中，用甲醇稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.4 樣品溶液的制備

精密稱取小花鬼針草藥材粉末(過 3 號(hào)篩)1 g，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇溶液10 mL，密塞，稱重。室溫下超聲提取60 min。提取后放至室溫，稱定質(zhì)量，用溶劑補(bǔ)足所失重量。取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后取濾液500 μL移至1.5 mL離心管中，加甲醇490 μL，內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液10 μL，混合均勻即得樣品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 專屬性考察

分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液(不含小花鬼針草藥材)進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為1 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件及2.2項(xiàng)下質(zhì)譜條件分析，得原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚的混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品總離子流圖，見圖1。由圖可知方法專屬性良好，各檢測成分間無相互干擾，且空白溶液(即陰性樣品溶液)對各檢測成分無影響。

1 原兒茶酸；2 蘆丁；3 金絲桃苷；4 槲皮苷；5 槲皮素；6 山奈酚；7 芍藥苷圖1 混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 EIC of mixed reference solution, test solution and negative sample solution

3.2 線性關(guān)系及定量限、檢測限考察

在2.1項(xiàng)色譜條件和2.2項(xiàng)質(zhì)譜條件下進(jìn)樣檢測不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，以各待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)物(芍藥苷)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各待測成分的線性回歸方程。選取信噪比(S/N)大于10時(shí)各待測物質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ)，S/N大于3時(shí)各待測物質(zhì)量濃度作為檢測限(LOD)，結(jié)果見表2。

表2 6種單體成分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢測限

3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.3項(xiàng)下的混合對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.04%、1.95%、1.50%、1.97%、2.04%、2.15%。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品溶液，配制后在室溫下放置，分別在0、4、8、12、18 、24 h時(shí)進(jìn)樣檢測，計(jì)算各待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為原兒茶酸1.91%、蘆丁2.03%、金絲桃苷1.46%、槲皮苷 2.04%、、槲皮素2.13%、山奈酚2.51%。結(jié)果表明，樣品溶液在室溫條件下，24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取小花鬼針草粉末1 g，精密稱定，照2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行制備6份，進(jìn)樣檢測，并計(jì)算實(shí)測濃度。6份平行樣品各待測物實(shí)測濃度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為原兒茶酸1.35%、蘆丁1.65%、金絲桃苷 1.46%、槲皮素 4.49%、槲皮苷4.44%、山奈酚4.97%。

3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取小花鬼針草粉末1 g，精密稱定，平行稱6份。精密稱取原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚對照品適量，用甲醇溶解并定容，配制成各成分濃度分別為原兒茶酸115.6 μg/mL、蘆丁130.7 μg/mL、金絲桃苷80.2 μg/mL、槲皮苷45.2 μg/mL、槲皮素34.8 μg/mL、山奈酚10.2 μg/mL的對照品混合溶液。每份樣品中1.00 mL上述對照品混合溶液，揮干溶劑，按2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.1與2.2項(xiàng)下的條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算各成分的含量及回收率。結(jié)果見表3。

表3 6種待測成分的回收率實(shí)驗(yàn)

續(xù)表3

3.7 樣品測定

對樣品溶液進(jìn)行含量測定，得到小花鬼針草中原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為105.52 μg/g(RSD=1.35%，n=6)、120.05 μg/g(RSD=1.65%，n=6)、70.02 μg/g(RSD=1.46%，n=6)、44.88 μg/g(RSD=4.49%，n=6)、29.94 μg/g(RSD=4.44%，n=6)、9.33 μg/g(RSD=4.97%，n=6)。

3.8 討論

3.8.1 色譜條件優(yōu)化

在進(jìn)行6種待測成分檢測時(shí)，為避免出現(xiàn)峰拖尾的現(xiàn)象，同時(shí)為了提高電離效率，在水相中加入少量甲酸，即選擇0.1%甲酸水作為水相。6種待測成分中蘆丁和金絲桃苷保留時(shí)間接近，色譜完全分離較困難。本文嘗試采用不同的色譜柱(Agilent SB-C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm；Agilent Eclipse C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm)，不同的流動(dòng)相組合(乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水)及不同的流動(dòng)相比例來實(shí)現(xiàn)兩者的完全色譜分離。結(jié)果表明，采用Agilent Eclipse C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm色譜柱及甲醇體系，兩者分離效果差，所以最終選擇Agilent SB-C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，靈敏度高，分析時(shí)間短，各待測物分離效果好，方法專屬性強(qiáng)。

3.8.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本文嘗試采用SIM模式對待測成分進(jìn)行定量檢測，該模式下方法專屬性差，樣品溶液中干擾較多。6種待測成分及內(nèi)標(biāo)物在MS2Scan及Product Ion兩種掃描模式下，均可獲取母離子及子離子信息，且Negative模式下靈敏度明顯優(yōu)于Positive模式，所以本文采用負(fù)離子MRM模式檢測6種待測成分，同時(shí)采用optimizer工作站對6種待測成分及內(nèi)標(biāo)物的Fragmentor碎裂電壓、CE碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，以確保各待測成分的高響應(yīng)值和高靈敏度。

3.8.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

進(jìn)行6種待測成分含量檢測時(shí)，為避免儀器進(jìn)樣誤差等，本文采取內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)物的選擇至關(guān)重要，其結(jié)構(gòu)應(yīng)與待測成分類似，保留時(shí)間相近，且不得存在于小花鬼針草提取物中。本文通過對甘草酸銨、芍藥苷、異鼠李素等化合物進(jìn)行分析，綜合其保留時(shí)間，最終選擇芍藥苷作為內(nèi)標(biāo)物。

4 結(jié)論

本研究建立的UPLC-MS/MS分析方法，可快速分離檢測小花鬼針草中原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚的含量。該方法簡單快捷、靈敏度高，可為小花鬼針草藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。