液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定不同軟膏中的莫匹羅星

胡玉芬，王麗娟，薛富民

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014)

莫匹羅星是熒光假單胞菌的天然發(fā)酵產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特(見圖1)，而且是近年來臨床上使用的惟一的異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的競爭抑制劑[1]。莫匹羅星通過競爭抑制作用，與細(xì)菌接觸時(shí)可與異亮氨酸轉(zhuǎn)移RNA合成酶結(jié)合，從而抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡，這是莫匹羅星發(fā)生作用的基本原理。另外，莫匹羅星在進(jìn)入體內(nèi)后能夠被迅速吸收，且很快被體內(nèi)臟器所水解，其血清半衰期通常低于30 min。莫匹羅星獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗菌作用機(jī)制，決定了其具有良好抗菌作用的同時(shí)，與其他各類抗生素?zé)o交叉耐藥，且長期使用不易產(chǎn)生耐藥性[2]。因此，莫匹羅星可作為局部外用抗生素，對(duì)與皮膚感染有關(guān)的各種革蘭氏陽性球菌、某些革蘭氏陰性菌有一定的抗菌作用，適用于革蘭氏陽性球菌引起的皮膚軟組織的感染，如膿皰瘡、癤、毛囊炎等原發(fā)性感染以及濕疹、皮炎、潰瘍、外傷等皮膚病的繼發(fā)感染[3-10]。顯然，在各種制劑中莫匹羅星含量多少與藥效有直接的關(guān)系，建立針對(duì)制劑中莫匹羅星含量的高效、準(zhǔn)確分析方法具有重要意義。但是，目前關(guān)于莫匹羅星檢測方法的報(bào)道較少，呂亞光等[11-13]報(bào)道了利用液相色譜法檢測軟膏或噴霧劑中莫匹羅星的含量，馬爾蒂·瓦拉等[14]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法只是檢測莫匹羅星的代謝產(chǎn)物，而沒有報(bào)道針對(duì)樣品中有效成分莫匹羅星的分析方法。另外，耿悅等[15-16]利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測莫匹羅星軟膏中的雜質(zhì)及其降解產(chǎn)物，也沒有對(duì)軟膏中有效成分莫匹羅星進(jìn)行檢測方法的研究。在《中國藥典》2015年版二部中[17]，也未收錄莫匹羅星的檢測方法。上述文獻(xiàn)報(bào)道的液相色譜法檢測莫匹羅星靈敏度低、干擾多，對(duì)于痕量非法添加則不能準(zhǔn)確測定。目前，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定軟膏中莫匹羅星的含量鮮有報(bào)道。因此，亟需建立一種高效、可靠的針對(duì)莫匹羅星的檢測方法。本實(shí)驗(yàn)嘗試采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測莫匹羅星含量，并用于軟膏中莫匹羅星的快速檢測。

圖1 莫匹羅星結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of mupirocin

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200型RRLC-6410型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技公司)。

1.2 藥品與試劑

樣品為某市售莫匹羅星軟膏(莫匹羅星質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)、青鵬軟膏、救生堂古方膏。莫匹羅星對(duì)照品 (中國食品藥品檢驗(yàn)研究院，規(guī)格：100010， 100 mg，純度：94.2%)；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純，所用水均為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相： A：0.1%甲酸-水，B：乙腈；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫條件：0～7 min，B：30%～90%；7～7.1 min，B：90%～30%；7.1～11 min，B：30%。

ESI離子源正離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式下選擇離子對(duì):501.3→326.7、501.3→308.9和501.3→291。

2.2 對(duì)照品貯備液的制備

精密稱取莫匹羅星對(duì)照品 10.615 7 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理 10 min，溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品貯備液。

2.3供試品溶液的制備

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。提取莫匹羅星特征離子對(duì)501.3→326.7、501.3→308.9和501.3→291的總離子流圖，莫匹羅星對(duì)照品出峰時(shí)間在5.45 min左右，陰性供試品在莫匹羅星峰處無干擾峰，陰性供試品加標(biāo)出峰時(shí)間在5.45 min左右，表明本實(shí)驗(yàn)條件適用于測定莫匹羅星，色譜圖見圖2。

圖2 專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖Fig.2 Chromatograms of specificity experiments

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取莫匹羅星對(duì)照品貯備液適量，用流動(dòng)相稀釋制成含莫匹羅星10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的系列溶液，在選定的色譜條件下，進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖。以峰面積積分值y為縱坐標(biāo)、莫匹羅星質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=115.211 3x(r=0.999 5)。結(jié)果表明，莫匹羅星檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10～500 ng·mL-1。

2.6 檢測限和定量限

取莫匹羅星對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，按上述條件進(jìn)樣分析，在滿足檢測要求的情況下，最終確定4 ng·mL-1為方法的檢測限濃度，10 ng·mL-1為方法的定量限濃度。樣品添加10 ng·mL-1定量限濃度對(duì)照品溶液的質(zhì)譜檢測色譜圖如圖3所示。

圖3 樣品添加10 ng·mL-1定量限濃度對(duì)照品溶液色譜圖Fig.3 Chromatograms of spiked sample with 10 ng·mL-1 control

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

100 ng·mL-1對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次測定，記錄峰面積。結(jié)果，莫匹羅星峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%(n=6)，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取樣品1 g，分別精密加入對(duì)照品貯備液適量，按2.2項(xiàng)下方法制備并進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，低、中、高濃度的加標(biāo)回收率(n=3)分別為99.8% 、109.2% 和105.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)分別為3.5%、1.6%和1.4%，詳見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.9 樣品含量測定

分別精密稱取3批莫匹羅星軟膏、青鵬軟膏、救生堂古方膏樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定并計(jì)算，結(jié)果表明青鵬軟膏、救生堂古方膏中未檢出莫匹羅星；莫匹羅星軟膏中莫匹羅星含量為2%，符合莫匹羅星軟膏的標(biāo)定含量。

3 結(jié)論

文中建立了不同軟膏中莫匹羅星含量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，該方法線性范圍寬，檢出限低，專屬性好，靈敏度高，簡便、快速，可用于不同軟膏中莫匹羅星的檢測。對(duì)于莫匹羅星含量相對(duì)較高的軟膏可以準(zhǔn)確測定，如莫匹羅星軟膏，經(jīng)檢測與其標(biāo)定含量一致；對(duì)于市售一些消炎藥膏，不含有莫匹羅星，如青鵬軟膏，經(jīng)檢測確實(shí)未檢出莫匹羅星；對(duì)于某些保健品中痕量非法添加莫匹羅星，該方法也能進(jìn)行測定，如救生堂古方膏，經(jīng)檢測未檢出莫匹羅星。