山東長清栝樓及丹參根結(jié)線蟲病原蟲種類研究

韓坤鵬，劉楊，萬鵬

(山東中醫(yī)藥大學， 山東 濟南 250355)

栝樓，其果實稱為瓜蔞，根部稱為栝樓，功能主治肺熱咳嗽、胸痹心痛等癥狀[1-2]。在政府和農(nóng)技部門的十力支持下,長清區(qū)這幾年大力發(fā)展栝樓產(chǎn)業(yè),讓栝樓形成了種植、生產(chǎn)、加工、銷售一條龍的區(qū)域特色產(chǎn)業(yè)，然而根結(jié)線蟲病是栝樓重要病害之一，其危害也日趨嚴重，影響瓜農(nóng)的經(jīng)濟效益，對栝樓根結(jié)線蟲病的研究有著迫切的需要。

丹參又名赤參，為草本植物，是根部入藥的重點藥材，有活血調(diào)經(jīng)，養(yǎng)血安神之功效[3]。長清區(qū)種植丹參有300余年的歷史，具有適宜藥材生長的自然條件，歷經(jīng)多年研究，也培育出了優(yōu)質(zhì)丹參。然而根部的病蟲害仍然是困擾丹參種植的主要問題。因此，對丹參根部病蟲害的研究具有重要的意義。

近年來，寄生線蟲尤其是根結(jié)線蟲對中藥材的危害，在很大程度上影響了藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。而關(guān)于影響藥材生長的根結(jié)線蟲病的研究較少，特別是對藥材栝樓和丹參根結(jié)線蟲病的病原蟲研究最近幾年未有新的進展[4-7]，病原也并不明確。為確定長清馬山鎮(zhèn)中藥材線蟲病的主要病原，明確其危害，本實驗提取發(fā)病植株體內(nèi)的線蟲，進行顯微觀察，根據(jù)線蟲的外觀特征初步鑒定病原線蟲，以期為該地區(qū)根結(jié)線蟲病的防治起到積極的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 取樣范圍

實驗所需藥材于2017年5月上旬采自濟南市長清區(qū)馬山，5月中旬采自濟南市長清區(qū)山東中醫(yī)藥大學苗圃。

1.1.2 取樣方法

在固定點選取病株，在其植株附近，用鐵锨除去地表其他雜草等物后，挖取10～15 cm土層的根系。

1.1.3 重復取樣

采集丹參標本6份，采集栝樓標本4份，將采集到的植株病根放到事先準備好的封口袋中，在標簽上注明時間和地點。

1.1.4 樣本處理

樣本要立即處理，或冰箱中冷藏(5～10 ℃)。

1.2 實驗方法

1.2.1 線蟲的分離方法

在苗圃將藥材根取回實驗室，用清水輕輕沖干凈病根上的泥土，然后將病根切成0.5 cm左右的細根塊，采用貝曼漏斗法(Baermann funnel)將線蟲與根分離。選用直徑10～14 cm的漏斗，剪取一小段橡膠管接在下方，乳膠管上加一個止水夾后置于漏斗架。在漏斗中裝入無菌清水，將切碎的根塊用兩層韌性好的衛(wèi)生紙包好，放入清水中，水量沒過根塊即可。待24 h之后，將橡膠管上的止水夾打開，收集漏斗底部大概5 cm處液體[8]。

1.2.2 TAF固定液配制

7 mL 體積分數(shù)40%的甲醛與2 mL三乙醇胺加45.5 mL水[9]。

1.2.3 臨時裝片制作與觀察

選一次性滴管吸少量含有線蟲的溶液，滴一滴在載玻片上，蓋上載玻片，不要產(chǎn)生氣泡，然后用濾紙吸取多余液體，防止污染物鏡。在顯微鏡下觀察線蟲特征。

1.2.4 線蟲的滅活與固定

試管取3 mL線蟲溶液，將水浴鍋加熱到65 ℃，試管用試管夾夾住，在水浴鍋內(nèi)加熱2～ 3 min，直到線蟲死亡，立即加入3 mLTAF固定液(等量即可)[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲病癥狀描述

感染根結(jié)線蟲病的病根上有類圓形根結(jié)，單個或成串，成念珠狀，癥狀明顯。其主要危害在于根部瘤狀突起、腐爛、生長不良、漚根，同時也會使植株枯枝枯葉、黃化，扭曲萎蔫、植株矮小、生長緩慢。生病根上生長著很少的須根，老根也會反復侵染線蟲，長成形態(tài)較大的不規(guī)則類圓形凸起。開始為白色，10～12 d后會呈黑色，易腐爛，脫落，木質(zhì)部露出[12-13]。待線蟲長到一定大小可以在解剖鏡下直接解剖提取線蟲，線蟲形態(tài)小，身體透明，需得借助光學顯微鏡等儀器觀察[14]。

2.2 病原種類鑒定

2.2.1 丹參植物根中根結(jié)線蟲主要類型

2.2.1.1 南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)

新幼蟲特征：唇部平坦；有球形中食道，瓣門突出；尾部無色透明，身體末端有明顯特征，尾部有小部分皺縮。幼蟲尾尖尖圓。如圖1所示。

A線蟲尾部(×400) ；B線蟲頭部(×400)；C線蟲整體觀(×200)圖1 南方根結(jié)線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.1 Morphology of Meloidogyne incognita under optical microscope

2.2.1.2 纖毛棘刺線蟲(Helicotylenchusapiculus)

雄蟲：線蟲經(jīng)溫熱殺死后呈直線形或稍稍向內(nèi)彎曲，雄蟲比雌蟲略長，體形更加纖細。雄蟲口針較不發(fā)達，食道部分退化。交合傘長包至尾端后。如圖2所示。

實驗材料中未見雌蟲。

A線蟲頭部(×400) ；B線蟲中部(×400)；C線蟲尾部(×400)圖2 纖毛棘刺線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.2 Morphology of Helicotylenchus apiculus underoptical microscope

2.2.1.3 咖啡短體線蟲 (Pratylenchuscoffeae)

雌蟲：體形粗短，經(jīng)溫熱殺死后蟲體變僵直或略彎曲。皮紋明顯，有4條側(cè)線，側(cè)帶非網(wǎng)狀。唇區(qū)低且稍皺縮，2 條平唇環(huán) 。頭架輕度骨化，向蟲體后延伸一個體環(huán)的距離?？卺槾侄糖野l(fā)達，基部球呈圓形。背食道腺在口針基部球。有類圓形中食道球。有前伸單卵巢。尾部呈類圓柱形，尾端無紋，多數(shù)平截，少部分線蟲尾部有一個明顯的凹痕。

雄蟲：雌、雄蟲數(shù)目特征基本一致。雄蟲的前體較窄，口針基部球?qū)挾壬贤嘶黠@。雄蟲的交合刺成對存在，纖細，約 17 μm。如圖3所示。

A線蟲頭部(×400)； B線蟲尾部(×400)；C線蟲整體觀(×200)圖3 咖啡短體線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.3 Morphology of Pratylenchus coffeae under optical microscope

2.2.1.4 穿刺短體線蟲 (Pratylenchuspenetrans)

雌蟲：線蟲水浴加熱殺死后蟲體僵直或稍稍向腹部彎曲，體紋纖細;唇區(qū)較高，無皺縮，唇環(huán)3 ，前部平坦。頭架較發(fā)達，外緣向后延伸與第 1 條體環(huán)相連?？卺槹l(fā)達且粗短，有較寬的基部球?；壳蛟诒呈车老偾胺?。雌蟲中食道球近圓形，清晰易觀察，瓣膜明顯，寬度約等于該處體的半徑。單卵巢，有較大的圓形受精囊，約等于3/4體寬的 ，可見其充滿精子。陰道長約體寬的 1/4，較直。尾部體環(huán)明顯，尾的中上部有側(cè)尾腺口。蟲尾呈錐形或錐圓形，末端鈍圓無紋。 如圖4所示。

樣本中未見雄蟲。

A線蟲整體觀(×200)； B線蟲頭部(×400)； C線蟲尾部(×400)圖4 穿刺短體線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.4 Morphology of Pratylenchus penetrans under the optical microscope

2.2.1.5 美洲劍線蟲(Xiphinemaamericanum)

雄蟲：有高唇區(qū)，呈球形，骨化不明顯。唇環(huán)有3到5 個，縊縮，側(cè)唇、食道、口針皆退化，中食道球和瓣膜不明顯，針狀口針，無基部球。單精巢。復合刺強壯，末端尖。交合傘至尾長 2/3 處，雄蟲末端純圓或尖。如圖5所示。樣本中未見雌蟲。

A線蟲頭部(×400)； B線蟲尾部(×400)； C線蟲整體觀(×200)圖5 美洲劍線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig. 5 Morphology of Xiphinema americanum under the optical microscope

2.2.2 栝樓中主要線蟲類型

2.2.2.1 假強壯螺旋線蟲 (Helicotylenchuspseudorobustus)

蟲體經(jīng)水浴加熱殺死后，大部分線蟲體前端較直而尾端彎成環(huán)形，有少部分彎曲較大呈 “C” 形。蟲體側(cè)區(qū) 4 條側(cè)線，體前端網(wǎng)格化。半圓形唇區(qū)，與蟲體相連無間隔，有若干個不太明顯的環(huán)紋。口針發(fā)達，基部球明顯，前部平坦或稍稍凹起。有卵圓形的中食道球，位于排泄孔后方。受精囊呈卵形。線蟲尾部有明顯的腹突和細紋。側(cè)尾腺開口先于肛門，呈小孔狀。如圖6所示。

A線蟲尾部(×400)； B線蟲頭部(×400)；C線蟲整體觀(×400)圖6 假強壯螺旋線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig 6 Morphology of Helicotylenchus pseudorobustus under the optical microscope

2.2.2.2 美洲劍線蟲 (Xiphinemaamericanum)

雌蟲：蟲體中部圓柱形，頭部和尾部較之細，水浴65 ℃加熱殺死后，蟲體呈“C”形或“J”形。表皮環(huán)紋很細。唇區(qū)前端平坦，中部稍稍凹起，頭部縊縮。齒針長 128～143 μm，齒針延伸部分的基部膨大。食道與腸分界清晰。對伸雙卵巢。陰門長約體寬的1/4，位于體長2/1處。尾圓錐形，背面略拱起，尾長于肛門處體寬， 有尾乳突約4個。 幼蟲水浴加熱殺死后呈“C”形。如圖7所示。

圖7 美洲劍線蟲光學顯微鏡下形態(tài)(×200)Fig. 7 Morphology of Xiphinema americanum under the optical microscope

3 討論與結(jié)論

瓜蔞和丹參是我省重要的道地藥材，隨著種植年限的延長和連作面積的增加，丹參和栝樓根部病害發(fā)生逐年加重，給這兩種植物的生產(chǎn)安全帶來嚴重威脅。但目前對根結(jié)線蟲病害的研究還遠遠不夠。

本文根據(jù)對長清地區(qū)6份丹參樣本、4份栝樓樣本共 10份樣本的分離鑒定，共鑒定出以下6種線蟲：咖啡短體線蟲(Pratylenchuscoffeae)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、纖毛棘刺吸蟲(Helicotylenchusapiculus)、美洲劍線蟲(Xiphinemaamericanum)、穿刺短體線蟲(Pratylenchuspenetrans)、假強壯螺旋線蟲(Helicotylenchuspseudorobustus)。根據(jù)以上結(jié)果，說明感染植物根結(jié)線蟲病的藥材根中并非只有一種線蟲，即藥材根結(jié)線蟲病發(fā)生時可能被多種線蟲感染。實驗中所取的感染根結(jié)線蟲病的丹參病根中以咖啡短體線蟲數(shù)量最多，其次是美洲劍線蟲。

本研究結(jié)果表明，一些植物根寄生線蟲雖然寄主多樣，但不同植物的根結(jié)線蟲有很大差異，對于每種的線蟲具體防治方法需要更深一步地探討。因此，在丹參與栝樓的種植過程中，為防治根結(jié)線蟲的危害，應(yīng)盡量選用無病種苗、合理施肥、科學輪作、倒茬和寬、窄行高壟栽培等農(nóng)業(yè)措施為主，移栽前穴施毒土、藥液浸根和生長期藥劑灌根相結(jié)合的綜合防治措施，這樣能夠更加高效且綠色環(huán)保地促進丹參和栝樓的種植和產(chǎn)量。