ER陽性乳腺癌中FGFR1蛋白的表達(dá)與ER及預(yù)后的關(guān)系

王宇航，宋全福，吳俊強(qiáng)，南丁阿比雅斯，阿勒哈，龐 達(dá)，姜永冬

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，黑龍江 哈爾濱 150081；

2.阿勒泰地區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，新疆維吾爾族自治區(qū) 阿勒泰 836000；

3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，黑龍江 哈爾濱 150081

乳腺癌作為女性常見的惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)每年乳腺癌新發(fā)病例約140萬例，其發(fā)病率在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家中均呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。在乳腺癌病例中，雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽性的患者比例約70%[3]，且隨著乳腺癌診療技術(shù)的日臻完善和輔助內(nèi)分泌治療的廣泛應(yīng)用，此類患者往往預(yù)后較好。然而，激素敏感型乳腺癌患者有時卻并不能從內(nèi)分泌治療中獲益，約30%的ER陽性患者內(nèi)分泌治療無效[4]。目前，內(nèi)分泌治療耐藥已成為一個亟待解決的問題。

成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs）是一類具有自身磷酸化活性的受體酪氨酸激酶[5-7]，在細(xì)胞的生長和分化、新生血管形成及損傷修復(fù)等諸多生物學(xué)過程中均發(fā)揮著重要作用[8-9]。FGFRs通過基因突變、融合蛋白、差異表達(dá)和受損的成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）信號的減量調(diào)節(jié)等途徑導(dǎo)致酪氨酸激酶受體持續(xù)活化，與包括乳腺癌在內(nèi)的諸多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10-13]。FGFR1是FGFRs家族成員之一，有研究表明，F(xiàn)GFR1基因在約10%的乳腺癌中存在擴(kuò)增，而該基因的擴(kuò)增與其過表達(dá)直接相關(guān)，并能夠?qū)е氯橄侔?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移增加及患者生存率降低，尤其在ER陽性和（或）低分化的乳腺癌中更為顯著[14]。同時，F(xiàn)GFR1的高表達(dá)常與ER陽性乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療耐藥有關(guān)，這一現(xiàn)象已得到證實[15]，但其導(dǎo)致耐藥的具體作用機(jī)制目前尚無定論。這提示FGFR1對乳腺癌預(yù)后的不良影響，有相當(dāng)一部分原因來自其對于抗雌激素治療的負(fù)面作用。因此，研究FGFR1介導(dǎo)的內(nèi)分泌治療的耐藥機(jī)制，對于改善ER陽性乳腺癌患者的預(yù)后具有重要臨床意義。

既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1高表達(dá)常發(fā)生于Luminal型乳腺癌中，并且FGFR1的表達(dá)與患者的ER及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER 2）狀態(tài)有關(guān)[16]，這些現(xiàn)象均提示FGFR1與ER之間存在潛在關(guān)系。因此，本研究通過檢測ER陽性乳腺癌樣本中FGFR1蛋白水平，結(jié)合患者的臨床病理特征加以統(tǒng)計分析，試圖明確FGFR1蛋白的表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)特征，尤其是與患者ER表達(dá)水平之間的關(guān)系，并探討FGFR1蛋白的表達(dá)與ER陽性乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2008年9月—2011年12月收治的184例ER陽性乳腺癌患者，平均年齡為（50.16±10.47）歲。入選患者均是于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院首次確診，通過術(shù)前乳腺穿刺活檢或手術(shù)切除活檢證實為乳腺癌，根據(jù)術(shù)后免疫組織化學(xué)分析結(jié)果確定患者的ER狀態(tài)。入選者要求無其他腫瘤病史或腫瘤家族史，術(shù)前未接受新輔助放化療。患者的一般情況見表1。

表1 研究對象的基本特征Tab.1 Disease characteristics of the study population[n (%)]

1.2 免疫組織化學(xué)方法

入選的184例乳腺癌患者的組織樣本均采用免疫組織化學(xué)方法檢測FGFR1蛋白的表達(dá)情況。采用Benchmark XT自動染色儀（美國Ventana Medical Systems公司）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，使用的FGFR1抗體（兔抗人多克隆抗體，英國Abcam公司）的稀釋比例為1∶2 000。簡要操作步驟如下：取4 μm厚的石蠟組織切片，經(jīng)脫蠟、水化、梯度乙醇（95%、75%和50%）處理后，置于PBS中漂洗。加入3%H2O2耗竭內(nèi)源性過氧化物酶，而后依次溫育一抗和二抗并顯色。FGFR1高、低表達(dá)的典型組織切片見圖1。ER、PR、HER-2、Ki-67、p53（ZM-0104、ZM-0215、ZM-0065、ZM-0165和ZM-0405，均為小鼠抗人單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）的免疫組織化學(xué)方法同上。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定：① ER和PR可見明顯細(xì)胞核著色且≥1%為陽性，無著色或陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＜1%和著色弱且陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＞1%為陰性[17]，同時根據(jù)Allred等[18]的評分方法，依照陽性細(xì)胞所占比例分為1+、2+、3+。② HER-2可見細(xì)胞膜著色，＞10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)、完整、均勻細(xì)胞膜著色（3+），定義為陽性；無著色或≤10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的微弱的細(xì)胞膜著色（0分），＞10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的微弱的細(xì)胞膜著色（1+），兩者為陰性；＞10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不完整和（或）弱至中等強(qiáng)度的細(xì)胞膜染色或≤10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色（2+），均為不確定性[19]。③ Ki-67、p53抗體染色陽性結(jié)果為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒，Ki-67標(biāo)記指數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)St.Galeen共識，陽性細(xì)胞數(shù)≥14%為高陽性率，＜14%為低陽性率[20]；p53判斷標(biāo)準(zhǔn)，陽性細(xì)胞數(shù)＞10%為陽性，≤10%為陰性。④ FGFR1蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以所有細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞的百分率（0%～100%）進(jìn)行評估，選用10%的臨界值作為高低表達(dá)的評判標(biāo)準(zhǔn)[21]，≥10%為FGFR1蛋白高表達(dá)，＜10%為FGFR1蛋白低表達(dá)（圖1）。所有免疫組織化學(xué)切片由2名病理醫(yī)師分別閱片，結(jié)果一致者為最后判定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

圖1 ER陽性乳腺癌組織切片中FGFR1蛋白表達(dá)情況Fig.1 Representative sections of FGFR1 protein expression in ER-positive breast cancer

使用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗分析FGFR1蛋白水平與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，Spearman相關(guān)分析評估變量間是否存在相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，并繪制總生存曲線；采用COX回歸進(jìn)行多因素生存分析，以評估乳腺癌風(fēng)險因素。顯著性檢驗均采用雙側(cè)概率檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FGFR1蛋白水平與ER陽性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

本研究對184例ER陽性乳腺癌患者的FGFR1蛋白水平進(jìn)行了檢測，并通過χ2檢驗分析FGFR1蛋白水平與ER陽性乳腺癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性（表2）。結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR1蛋白高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.012），且FGFR1蛋白的表達(dá)與ER的表達(dá)水平顯著相關(guān)（P=0.011）。進(jìn)一步通過Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)（r=0.186），與ER表達(dá)水平負(fù)相關(guān)（r=-0.221）。此外，在腫瘤臨床分期、腫瘤大小、組織學(xué)分級、PR、HER-2及P53水平上，F(xiàn)GFR1高低表達(dá)的患者間無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 FGFR1蛋白的表達(dá)與ER陽性乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab.2 Associations between FGFR1 expression and clinicopathological features of ER-positive breast cancer

2.2 FGFR1蛋白水平對ER陽性乳腺癌患者預(yù)后的影響

本研究對臨床分期、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、ER、PR、HER-2、Ki-67標(biāo)記指數(shù)、P53和FGFR1蛋白水平等預(yù)后因素進(jìn)行了分析。在COX單因素分析中，ER陽性乳腺癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、Ki-67陽性率與FGFR1蛋白的表達(dá)水平及預(yù)后顯著相關(guān)（表3）。

表3 COX風(fēng)險比例模型中相關(guān)因素對乳腺癌預(yù)后的影響Tab.3 Prognostic factors of ER-positive breast cancer in COX regression analysis

為消除混雜因素及各因素之間交互作用的影響，本研究將單因素分析中臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、Ki-67陽性率和FGFR1蛋白的表達(dá)共同納入COX多因素分析進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和Ki-67陽性率是ER陽性乳腺癌患者預(yù)后的獨立風(fēng)險因素，OR為1.744（95%CI：1.002～3.034，P=0.049）和1.882（95% CI：1.015～3.491，P=0.045）。此外，本研究還運(yùn)用Kaplan-Meier法對不同F(xiàn)GFR1表達(dá)水平的ER陽性乳腺癌患者的總生存率進(jìn)行了分析（圖2）。結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR1蛋白高水平的患者的總生存率比低表達(dá)的患者更低，預(yù)后較差（P=0.036）。

圖2 FGFR1蛋白水平與ER陽性乳腺癌患者總生存時間的關(guān)系Fig.2 Kaplan-Meier analysis for overall survival in ER-positive breast cancer patients,based on FGFR1 protein level

3 討 論

為研究FGFR1表達(dá)對ER陽性乳腺癌患者的影響，本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測了184例ER陽性乳腺癌患者的FGFR1蛋白水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR1高表達(dá)的患者更易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且FGFR1蛋白的表達(dá)水平與患者ER的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，F(xiàn)GFR1是ER陽性乳腺癌患者的預(yù)后因素之一，F(xiàn)GFR1高表達(dá)顯著降低患者的總生存率。

FGFR1基因定位于染色體8p12上，已有大量研究證實該區(qū)域的拷貝數(shù)增加與FGFR1過表達(dá)顯著相關(guān)，并且約10%的乳腺癌中存在FGFR1基因擴(kuò)增[22-24]。在正常生理條件下，F(xiàn)GFR1的表達(dá)促使絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及蛋白激酶B的轉(zhuǎn)錄激活，最終調(diào)控管腔上皮細(xì)胞的生長和分化，與乳腺正常生長發(fā)育密不可分[25]。而異常高表達(dá)的FGFR1則能夠?qū)е翸APK和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等信號通路的異常激活[26-27]，且后者的活化與包括乳腺癌在內(nèi)的諸多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，關(guān)于FGFR1基因擴(kuò)增與乳腺癌相關(guān)性的研究較多，較為一致的觀點認(rèn)為其與乳腺癌患者的預(yù)后及對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)有關(guān)。Turner等[15]的研究表明，在Luminal型乳腺癌中，F(xiàn)GFR1基因擴(kuò)增和過表達(dá)可能導(dǎo)致預(yù)后較差，與內(nèi)分泌治療耐藥有關(guān)，并且還發(fā)現(xiàn)FGFR1基因拷貝數(shù)增加與FGFR1蛋白的表達(dá)水平升高存在一定關(guān)聯(lián)。Elsheikh等[14]的研究表明，F(xiàn)GFR1基因擴(kuò)增是乳腺癌的獨立預(yù)后因素。而本研究選取的研究對象均為ER陽性的乳腺癌患者，證明FGFR1蛋白的表達(dá)水平是ER陽性乳腺癌的預(yù)后因素之一，這與現(xiàn)有研究的結(jié)論相一致。

已有研究表明，F(xiàn)GFR1基因擴(kuò)增能夠?qū)е翬R陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療耐藥。Balko等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，1例術(shù)前接受來曲唑治療的雙側(cè)乳腺癌患者，其兩側(cè)病灶對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)不同，進(jìn)一步對患者的腫瘤組織樣本進(jìn)行基因芯片檢測，結(jié)果提示內(nèi)分泌治療效果較差的腫瘤組織中存在明顯的FGFR1基因擴(kuò)增。此外，聯(lián)合應(yīng)用布立尼布能夠增強(qiáng)他莫昔芬對ER陽性乳腺癌的療效[29]。目前，F(xiàn)GFR1介導(dǎo)內(nèi)分泌治療耐藥的作用機(jī)制仍未明確。有研究認(rèn)為FGFR1可能通過雌激素依賴/非依賴途徑激活MAPK和PI3K等腫瘤相關(guān)通路，進(jìn)而代償雌激素信號的缺失[14-15，30]。也有研究觀察到FGFR1信號通路的激活能夠抑制患者PR的表達(dá)[16]，這可能從一定程度上加劇了乳腺癌對內(nèi)分泌治療藥物的抵抗。而Formisano等[31]對應(yīng)用來曲唑治療的ER陽性腫瘤患者進(jìn)行Ki-67、FGFR1和RNA測序研究，雌激素缺乏的ER/FGFR1擴(kuò)增細(xì)胞的芯片分析顯示，F(xiàn)GFR1和ERα與DNA結(jié)合，并且調(diào)節(jié)ER依賴基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，用來曲唑治療的FGFR1基因擴(kuò)增患者腫瘤的RNA測序數(shù)據(jù)顯示雌激素反應(yīng)活躍且E2F靶基因豐富。ERα通路在雌激素缺乏的ER+/FGFR1-擴(kuò)增乳腺癌中仍然有效。眾所周知，乳腺癌患者ER的狀態(tài)與其對抗雌激素藥物的敏感性關(guān)系最為密切，而目前未見對FGFR1與ER表達(dá)水平之間的相關(guān)性進(jìn)行分析的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1的表達(dá)與ER陽性乳腺癌ER水平負(fù)相關(guān)，提示FGFR1可能通過抑制腫瘤細(xì)胞ER的表達(dá)介導(dǎo)內(nèi)分泌治療耐藥，該結(jié)果與之前的研究互為補(bǔ)充。

綜上所述，本研究從蛋白水平證實了FGFR1高表達(dá)對ER陽性乳腺癌預(yù)后的不良影響，并發(fā)現(xiàn)FGFR1蛋白水平與患者ER狀態(tài)之間呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為探索乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥機(jī)制提供了新思路，并且支持抗雌激素治療失敗的乳腺癌患者聯(lián)合應(yīng)用FGFR1拮抗劑以逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌治療耐藥，從而改善患者的預(yù)后，延長生存期。