VitD/VDR與乳腺癌患者免疫狀態(tài)、臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性研究

殷雋逸，王雅靈，胡海燕

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233

維生素D（vitamin D，VitD）是一種類固醇激素，其經(jīng)典功能是調(diào)節(jié)血清鈣磷濃度和骨代謝，同時(shí)有助于維持免疫、神經(jīng)和肌肉的正常功能。VitD可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、刺激細(xì)胞分化、抑制腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移并抗血管生成[1-2]。已有研究表明，循環(huán)25-羥基VitD[25-hydroxy VitD，25（OH）D]與VitD受體（VitD receptor，VDR）相互作用發(fā)揮抗癌效應(yīng)[3]。25（OH）D是VitD的活性代謝產(chǎn)物，可反映體內(nèi)VitD的儲備量。乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致女性死亡的主要原因。本研究通過對乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者及健康體檢者的外周血25（OH）D水平進(jìn)行檢測，分析乳腺癌患者外周血25（OH）D水平與乳腺癌患者T細(xì)胞免疫功能（CD4+/CD8+）、NK細(xì)胞水平、腫瘤大小、臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否骨轉(zhuǎn)移、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）是否陽性的相關(guān)性。同時(shí)通過免疫組織化學(xué)方法檢測乳腺癌組織中VDR的表達(dá)，分析其與乳腺癌臨床特征的相關(guān)性，以探究VitD/VDR途徑在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2015年1月—2018年7月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院收治的乳腺癌患者109例為乳腺癌組，年齡為31～79歲。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診，患者信息完整，術(shù)前未行放療、化療及內(nèi)分泌治療，也未服用VitD補(bǔ)充劑及鈣調(diào)節(jié)劑。選取同期經(jīng)病理確診的乳腺良性腫瘤患者50例為乳腺良性腫瘤組，年齡為26～71歲。在同期來上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的人群中隨機(jī)抽取2 000名健康體檢者作為對照組，并確認(rèn)無腫瘤、高血壓、糖尿病及冠心病等慢性疾病史。

1.2 樣品制備

乳腺癌組、乳腺良性腫瘤組及對照組受檢者抽取空腹靜脈血5 mL待檢測。乳腺癌組織標(biāo)本均來源于手術(shù)和穿刺活檢，標(biāo)本于4%多聚甲醛溶液中固定后石蠟包埋，每個(gè)石蠟標(biāo)本連續(xù)切片5張，切片厚度為4 μm。

1.3 方法

采用電化學(xué)發(fā)光法檢測109例乳腺癌患者、50例乳腺良性腫瘤患者及2 000名健康體檢者的外周血25（OH）D的水平?；瘜W(xué)發(fā)光分析儀、總25（OH）D檢測試劑盒及配套校準(zhǔn)品均購自瑞士Roche公司。將所采集的受試者空腹靜脈血靜置30 min，然后以3 000 r/min離心10 min，分離血清后及時(shí)上機(jī)檢測25（OH）D水平，檢測原理為競爭原理，檢測范圍為3.00～70.00 ng/mL。

使用Beckman Coulter Navios流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌患者外周血中T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞水平，各流式管中加入100 μL抗凝血并將20 μL的熒光單克隆抗體CD3-FITC/CD(16+56)-PE、CD4-FITC/CD8-PE分別加入其中，充分混勻后，室溫下避光溫育15 min；每管加入500 μL紅細(xì)胞裂解液OptiLyse C，渦旋混勻，室溫避光溫育10 min后加入2 mL PBS，渦旋混勻后1 500 r/min離心5 min，棄去上清液；加入500 μL PBS重懸后上機(jī)檢測。NK細(xì)胞水平以NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例表示，檢測CD4+/CD8+的比值，當(dāng)CD4+/CD8+＜1.4時(shí)為免疫力低下。

采用SABC免疫組織化學(xué)法對乳腺癌組織VDR的表達(dá)進(jìn)行檢測，步驟參照說明書，以TBS為一抗作為空白對照，以已知VDR陽性表達(dá)的乳腺癌組織作為陽性對照。兔抗人VDR單克隆抗體和免疫組織化學(xué)試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定使用組織學(xué)評分法，細(xì)胞質(zhì)中若出現(xiàn)粽色顆粒為陽性細(xì)胞，采用陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度相結(jié)合的方法進(jìn)行評分，每例患者切片均觀察10個(gè)高倍視野（×400），著色細(xì)胞計(jì)數(shù)比例＜5%為0 分，5%～2 5%為1 分，2 6%～5 0%為2 分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。染色強(qiáng)度無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者相乘，0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組、乳腺良性腫瘤組與對照組外周血25（OH）D水平比較

乳腺癌組外周血2 5（O H）D 水平為（1 8.0 0±6.9 3）n g/m L，低于乳腺良性腫瘤組[（2 6.7 6±8.5 6）n g/m L]和對照組[（27.03±8.95）ng/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乳腺良性腫瘤組與對照組外周血25（OH）D水平無明顯差異（P＞0.05，圖1）。

圖1 三組研究對象外周血25（OH）D水平比較Fig.1 Comparison of 25 (OH) D levels in peripheral blood of subjects in three groups

2.2 乳腺癌患者外周血25（OH）D與臨床特征的關(guān)系

乳腺癌患者中，T細(xì)胞免疫功能缺陷的患者外周血25（OH）D水平顯著低于T細(xì)胞免疫功能正常的乳腺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ期患者與Ⅲ、Ⅳ期患者相比，Ⅰ、Ⅱ期患者外周血25（OH）D水平顯著高于Ⅲ、Ⅳ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血25（OH）D水平顯著低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者外周血25（OH）D水平顯著低于未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PR陽性的乳腺癌患者外周血25（OH）D水平高于PR陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但外周血25（OH）D水平與腫瘤大小、ER表達(dá)無顯著相關(guān)性（P＞0.05，表1）。

2.3 乳腺癌患者外周血25（OH）D水平與NK細(xì)胞水平的關(guān)系

乳腺癌患者VitD缺乏組和VitD正常組NK細(xì)胞水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.4 乳腺癌VDR的表達(dá)與乳腺癌患者的臨床特征的關(guān)系

乳腺癌組織中VDR的表達(dá)與乳腺癌患者T細(xì)胞免疫功能、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而與患者ER、PR是否陽性具有顯著相關(guān)（P＜0.05，表3，圖2）

表1 乳腺癌患者外周血25（OH）D水平與患者臨床特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between peripheral blood 25 (OH) D level and clinical features of patients with breast cancer

表2 乳腺癌患者外周血25（OH）D與外周血NK細(xì)胞水平Tab.2 25 (OH) D and level of NK cells in peripheral blood of breast cancer patients

表3 乳腺癌VDR的表達(dá)與乳腺癌患者的臨床特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between expression of VDR in breast cancer and clinical features of breast cancer patients (n)

圖2 VDR在乳腺癌組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of VDR in breast cancer tissues

3 討 論

VitD是一種脂溶性的類固醇衍生物，在骨代謝和鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，近年來發(fā)現(xiàn)VitD具有潛在的抗癌作用，包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抑制炎癥、抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過程[4]。因而VitD與乳腺癌的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，VitD與乳腺癌之間關(guān)系的流行病學(xué)證據(jù)尚無定論，外周血25（OH）D的水平被認(rèn)為是體內(nèi)VitD狀態(tài)的主要生物標(biāo)志物，本研究通過檢測外周血25（OH）D水平，探討VitD在臨床中的意義。本研究顯示，乳腺癌患者外周血25（OH）D水平顯著低于乳腺良性腫瘤患者和健康體檢者，提示VitD在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)可能與體內(nèi)VitD水平有關(guān)，目前有關(guān)VitD水平與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)流行病學(xué)研究結(jié)果常常出現(xiàn)矛盾，不完全一致。這可能是由于乳腺癌的異質(zhì)性及數(shù)據(jù)的有限性。Chen等[5]在一項(xiàng)基于中國人群病例對照研究和一項(xiàng)觀察性研究的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，血漿25（OH）D質(zhì)量濃度每增加1 ng/mL可使乳腺癌發(fā)病率降低16%，與外周血25（OH）D水平在最低四分位數(shù)的女性相比，外周血25（OH）D水平在最高四分位數(shù)的女性罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，提示體內(nèi)VitD水平降低可能會增加中國人群的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Yao等[6]的研究亦表明，高水平VitD與乳腺癌發(fā)病率和死亡率風(fēng)險(xiǎn)較低有關(guān)，本研究結(jié)果與其相符。VitD除了調(diào)節(jié)鈣代謝外還是一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)劑，而T淋巴細(xì)胞細(xì)胞群是其主要的靶細(xì)胞之一[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中T細(xì)胞功能正常（CD4+/CD8+≥1.4）的患者外周血25（OH）D水平明顯高于T細(xì)胞免疫功能缺陷（CD4+/CD8+＜1.4）的患者，說明VitD的缺乏可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞細(xì)胞亞群數(shù)目及功能紊亂，使得機(jī)體的免疫功能下降，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者外周血25（OH）D水平顯著低于Ⅰ、Ⅱ期患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血25（OH）D水平顯著低于淋巴未結(jié)轉(zhuǎn)移患者，骨轉(zhuǎn)移患者外周血25（OH）D水平顯著低于未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者，較低的外周血25（OH）D水平與乳腺癌晚期、淋巴結(jié)受累、骨轉(zhuǎn)移、PR陰性等較差的預(yù)后相關(guān)。Palmieri等[9]發(fā)現(xiàn)，與患有早期乳腺癌的女性相比，患有局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的女性的VitD水平顯著降低。有研究發(fā)現(xiàn)，外周血25（OH）D水平較低的乳腺癌患者在診斷時(shí)罹患晚期腫瘤、淋巴結(jié)受累、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高[10]，提示低VitD水平在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用。

NK細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的第一道防線，通過細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)能力發(fā)揮抗腫瘤作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，1,25二羥基維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25（OH）2D3]通過miR-302c/miR-520c/NKG2D配體途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞對惡性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[11]。但本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者25（OH）D與外周血NK細(xì)胞數(shù)量沒有顯著相關(guān)性，這可能是由于VitD能增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，但不能增加NK細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)由于我們統(tǒng)計(jì)的是外周血1,25（OH）2D3水平，與25（OH）D濃度仍有差異。

VitD的生物學(xué)活性主要是由VitD的活性代謝物與VDR結(jié)合所介導(dǎo)的，配體結(jié)合導(dǎo)致VDR與類視黃醇X受體形成異二聚體，配體結(jié)合的VDR-RXR復(fù)合物與多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)中的VitD應(yīng)答元件（VitD response element，VDRE）結(jié)合，誘導(dǎo)基因表達(dá)的正或負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。這些靶基因參與多種分子途徑，從而通過自分泌和旁分泌介導(dǎo)VitD的抗癌作用[12-13]。目前關(guān)于乳腺癌組織中VDR表達(dá)與乳腺癌的臨床特征之間的研究較少，F(xiàn)riedrich等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織VDR的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)是否受累、腫瘤分級、腫瘤組織學(xué)類型、ER表達(dá)、PR表達(dá)、Ki-67增殖指數(shù)等均無顯著相關(guān)性，認(rèn)為VDR并不能作為乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)。而Ditsch等[15]研究則認(rèn)為乳腺癌中VDR的表達(dá)可能與較好的預(yù)后相關(guān)。本研究在探討乳腺癌患者VitD水平與乳腺癌臨床表征關(guān)系的同時(shí)還檢測了乳腺癌組織中的VDR的表達(dá)水平，并探討了乳腺癌中VDR的表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ER陽性患者中，VDR的陽性率顯著高于ER陰性患者，PR陽性患者中VDR的陽性率也同樣高于PR陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而乳腺癌中VDR的表達(dá)與乳腺癌患者T細(xì)胞免疫功能、臨床分期、腫瘤大小，淋巴結(jié)是否受累、是否骨轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性。Swami等[16]研究發(fā)現(xiàn)，活性VitD可抑制ER的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制因雌激素刺激導(dǎo)致的乳腺癌細(xì)胞增殖。在ER陽性和對VitD敏感的乳腺癌細(xì)胞中，VitD的抗雌激素作用可能部分是由于VDR在其配體激活后所介導(dǎo)的ER表達(dá)下調(diào)[17]。本研究結(jié)果顯示，雖然乳腺癌患者ER陰性的風(fēng)險(xiǎn)與外周血25（OH）D的水平無明顯相關(guān)性，但ER陽性的乳腺癌患者，VDR的陽性率明顯較高。因此，ER陽性同時(shí)VDR陽性的乳腺癌患者在抗雌激素治療的同時(shí)加用VitD，可為ER陽性乳腺癌患者的治療提供新方案。

VitD因其具有潛在的抗癌作用、免疫調(diào)節(jié)作用，且使用較為方便安全、不良反應(yīng)小而具有廣泛的研究前景。本研究初步探討了外周血25（OH）D、VDR與乳腺癌臨床特征的關(guān)系，較低的外周血25（OH）D水平與乳腺癌較差的預(yù)后特征相關(guān)，VDR的表達(dá)與ER、PR是否陽性相關(guān)，同時(shí)本研究結(jié)果結(jié)合既往文獻(xiàn)結(jié)論提示ER陽性且VDR陽性患者如果進(jìn)行抗雌激素治療時(shí)加用VitD，可能起到協(xié)同作用，但仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)及基礎(chǔ)的體內(nèi)外研究予以證實(shí)。